| License: Publishing license for publications including print on demand (31MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-286704
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.28670
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 22 August 2013 |
| Referee: | Prof. Dr. Gernot Längst |
| Date of exam: | 27 June 2013 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Lehrstuhl für Biochemie III > Prof. Dr. Gernot Längst |
| Keywords: | DNA triplex, triplex stability, nuclear matrix, rDNA organization, Tip5 |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 28670 |
Abstract (English)
After the description of the double helix structure by Watson and Crick, the function of DNA in the cell was seen as rather static, a long stretched out database of information, which was read and interpreted by the protein machinery doing all the interesting work. That notion however, quickly changed with the discovery of the DNA’s potential to adopt various alternative conformations, like ...
Abstract (English)
After the description of the double helix structure by Watson and Crick, the function of DNA in the cell was seen as rather static, a long stretched out database of information, which was read and interpreted by the protein machinery doing all the interesting work. That notion however, quickly changed with the discovery of the DNA’s potential to adopt various alternative conformations, like Z-DNA, quadruplex DNA or triplexes. Although initially characterized in vitro, these structures were soon implicated in the development of certain diseases and suggested to have possible roles in gene regulation and genome organization. The major focus thereby lay on the triplexes, three stranded structures comprising the DNA duplex and a single stranded RNA or DNA that binds in the major groove of the double helix. Strikingly, the recent advancements in high-throughput sequencing technology revealed the enrichment of putative triplex forming sequences within the regulatory regions of the genome. These observations combined with the discovery of an ever-growing number of functional ncRNAs, led to the assumption that triplex structures could present an interface between these ncRNAs and the chromatin.
The data in this thesis reveal that the intergenic spacer region of the mammalian rRNA genes contains a cluster of possible triplex forming sequences in its regulatory enhancer and terminator elements. The triplex forming potential of these motifs was predicted by in-silico analysis of the rDNA sequence and validated using EMSA experiments. Microscale thermophoresis (MST) assays were established to investigate the formation of triplex structures in various conditions in vitro. These experiments presented new insights on the characteristics of the triplex formation process and suggest the complex formation to be readily possible in physiological conditions. Thus the results provide the basis for further investigations on a possible role for enhancer-derived triplex forming ncRNAs in the regulation of the rRNA genes.
Besides their presence in regulatory gene regions, sequences prone to form non-canonical DNA structures were also shown to be part of matrix attachments regions (MARs) throughout the genome. These MAR sites are tethered to the nuclear matrix and mediate the anchoring of chromatin loops on this putative protein scaffold within the nucleus. The MAR elements are implicated to play various roles in transcriptional regulation and chromatin organization. Interestingly, MARs have also been shown to interact with specific MAR binding proteins and were implicated to form triplex structures with ncRNAs at the nuclear matrix. However, the exact nature of these processes and their implications for gene regulation and chromatin organization are so far poorly understood.
In the second part of this thesis Tip5, a subunit of NoRC, the key player in epigenetic rRNA gene repression, is revealed as nuclear matrix binding protein. The AT-hook and TAM domains of the protein are identified as motifs mediating the localization of Tip5 to the nuclear matrix. The results furthermore show a Tip5 dependent recruitment of rDNA repeats to the nuclear matrix upon rDNA repression. This suggests an additional role for the NoRC complex in the large-scale chromatin organization of the rRNA genes to the nuclear matrix. Thus the insights provided by these results are a good example for the interplay between MAR elements and their specific binders in large-scale chromatin organization.
In the course of these experiments the new extended AT-hook motif was discovered, which displays a DNA binding activity similar to canonical AT-hooks and moreover could be revealed as strong RNA binder. Initial in vivo experiments validated the importance of the eAT-hook domain for proper cellular localization of a candidate protein. Together these results suggest a role for the eAT-hook domain in chromatin organization, nuclear matrix binding and anchoring of proteins to structural DNA and RNA elements, similar to the canonical AT-hooks.
In summary the data presented in this thesis provides new insights on the characteristics and various roles for structured DNA elements and their specific binders in transcriptional gene regulation and nuclear matrix mediated chromatin organization.
Translation of the abstract (German)
Nach der Entdeckung der DNA Doppelhelix durch Watson und Crick wurde die Aufgabe der DNA in der Zelle zunächst als eher statisch angesehen. Die DNA galt als langgestreckter Informationsspeicher der nur von der Proteinmaschinerie abgelesen und interpretiert wird, welche dann die interessanten Aufgaben verrichtet. Diese Ansicht änderte sich jedoch nachdem gezeigt werden konnte, dass die DNA in der ...
Translation of the abstract (German)
Nach der Entdeckung der DNA Doppelhelix durch Watson und Crick wurde die Aufgabe der DNA in der Zelle zunächst als eher statisch angesehen. Die DNA galt als langgestreckter Informationsspeicher der nur von der Proteinmaschinerie abgelesen und interpretiert wird, welche dann die interessanten Aufgaben verrichtet. Diese Ansicht änderte sich jedoch nachdem gezeigt werden konnte, dass die DNA in der Lage ist neben der Doppelhelix zahlreiche weitere Strukturen wie Z-DNA, Quadruplex DNA oder Triplex DNA auszubilden. Obwohl zuerst nur in vitro beschrieben, wurden diesen Strukturen bald zahlreiche mögliche Funktionen in der Entwicklung bestimmter Krankheiten, sowie in der Genregulation und Genomorganisation zugeschrieben. Dabei waren die sogenannten DNA Triple Helices oder DNA Triplexstrukturen von Beginn an im Fokus. Diese können sich durch die Anlagerung eines DNA oder RNA Einzelstranges in die grosse Furche der DNA Doppelhelix an Homopolypurin oder Homopolypyrimidin Sequenzelementen ausbilden. Interessanterweise zeigten aktuelle Studien mittels der neuen “High Throughput Sequencing“ Technologien, das diese möglichen Triplexsequenzen in den regulatorischen Regionen des Genoms angereichert vorkommen. Zusammen mit der Entdeckung immer neuer ncRNAs führten diese Beobachtungen zu der Annahme, dass die Triplexstrukturen eine Rolle als Verbindungselemente zwischen diesen regulatorischen RNAs und dem Chromatin spielen könnten.
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass in den regulatorischen “Enhancer“ und “Terminator“ Regionen der Säuger rDNA eine Anhäufung zahlreicher möglicher Triplexsequenzen zu finden ist. Das Potential zur Bildung von Triplexstrukturen dieser Sequenzelemente wurde dabei mittels in-silico Analysen der rDNA Sequenzen bestimmt und mit der Hilfe von EMSA Experimenten bestätigt. Zusätzlich wurde mittels “Microscale Thermophoresis“ (MST) die Ausbildung von Triplexstrukturen unter verschiedenen Bedingungen in vitro untersucht. Diese Versuche lieferten neue Einblicke in die Charakteristika der Triplexbildung und enthüllten, dass eine Ausbildung dieser Strukturen auch unter physiologischen Bedingungen möglich ist. Auf diese Weise liefern die Ergebnisse eine Basis für weitere Untersuchungen einer möglichen Rolle potentieller Triplexstrukturen in den rDNA Enhancer Regionen in Bezug auf die Regulation der rRNA Gene.
Zusätzlich zu ihrem Auftreten in regulatorischen Regionen des Genoms konnte ausserdem gezeigt werden, das Sequenzelemente welche in der Lage sind alternative DNA Strukturen auszubilden häufig Bestandteil sogenannter “Matrix Attachment Regionen (MARs)“ des Genoms sind. Diese MAR Elemente werden an die nukleäre Matrix rekrutiert, wodurch die Verankerung, Organisation und Transkription von Chromatindomänen auf diesem Proteingerüst gesteuert wird. Interessanterweise konnte zudem nachgewiesen werden das MAR Elemente mit spezifischen MAR Bindeproteinen interagieren und möglicherweise mit ncRNAs Triplexstrukturen an der nukleäeren Matrix ausbilden. Die exakten Funktionen und Mechanismen dieser Vorgänge und ihre Auswirkungen auf die Regulation und Organisation des Genoms sind bisher allerdings nur schlecht charakterisiert.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wird Tip5 die regulatorische Untereinheit des NoRC Komplexes, welcher eine zentrale Rolle in der epigenetischen Abschaltung der rRNA Gene spielt, als Nukleärmatrix Bindeprotein beschrieben. Die TAM und AT-hook Domänen des Proteins spielen dabei eine zentrale Rolle in der Bindung des Proteins an die nukleäre Matrix. Darüber hinaus beschreiben die Ergebnisse eine Tip5 abhängige Rekrutierung von rDNA Kopien an die nukleäre Matrix nach einer Verminderung der rDNA Transkription. Dies deutet auf eine zusätzliche Rolle des NoRC Komplexes in der Organisation der übergeordneten Chromatinstruktur der rDNA an der nukleären Matrix hin und präsentiert ein gutes Beispiel für das Zusammenspiel von MAR Elementen und ihren spezifischen Interaktionspartnern in der Organisation von grösseren Chromatindomänen.
Im Rahmen dieser Untersuchungen wurde die neue “extended AT-hook (eAT-hook)“ Proteindomäne entdeckt, welche ähnliche DNA Bindungsaktivität wie die normale AT-hook Domäne aufweist und zudem starke RNA Bindungseigenschaften zeigt. Erste in vivo Experimente enthüllten darüber hinaus, das die Domäne essentiell für die korrekte zelluläre Lokalisierung eines Beispielproteins ist. Zusammen deuten diese Ergebnisse auf eine mögliche Rolle der eAT-hook Domäne in der Bindung von Proteinen an die nukleäre Matrix, sowie strukturelle DNA und RNA Elemente hin, ähnlich wie sie für die normale AT-hook Domäne beschrieben sind.
Zusammenfassend liefern die Ergebnisse dieser Arbeit neue Einblicke in die Charakteristika und verschiedenen Funktionen strukturierter DNA Elemente und deren spezifischer Bindungspartner in der transkriptionellen Genregulation und der Organisation von Chromatinstrukturen an der nukleären Matrix.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 01:57
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