| License: Publishing license for publications excluding print on demand (26MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-297968
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.29796
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 14 April 2014 |
| Referee: | Prof. Dr. Reinhard Sterner |
| Date of exam: | 4 April 2014 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Prof. Dr. Reinhard Sterner |
| Keywords: | enzyme design, enzyme mechanism, enzyme inhibitors, light regulation, ancestral sequence reconstruction |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 29796 |
Abstract (English)
The (βα)8-barrel fold is the most frequently observed topology among enzymes. Due to the spatial separation of their activity- and stability-mediating sites, (βα)8-barrel enzymes are extremely versatile and catalyze a wide array of cellular reactions. Thus, this particular fold provides an ideal tool for modifying catalytic activity and studying enzyme evolution. Several (βα)8-barrel enzymes are ...
Abstract (English)
The (βα)8-barrel fold is the most frequently observed topology among enzymes. Due to the spatial separation of their activity- and stability-mediating sites, (βα)8-barrel enzymes are extremely versatile and catalyze a wide array of cellular reactions. Thus, this particular fold provides an ideal tool for modifying catalytic activity and studying enzyme evolution.
Several (βα)8-barrel enzymes are involved in the metabolism of amino acids. Along these lines, N’-[(5‘-phosphoribosyl)formimino]-5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide isomerase (HisA) and the cyclase subunit of imidazole glycerol phosphate synthase (HisF) catalyze two consecutive steps in the biosynthesis of histidine, namely a sugar isomerization and a cycloligase/lyase reaction. By analogy with HisA, the enzyme phosphoribosyl anthranilate isomerase (TrpF) performs a chemically equivalent isomerization reaction within the biosynthesis of tryptophan. As HisA, HisF, and TrpF accommodate their phosphorylated substrates via a common phosphate binding site, an evolutionary linkage seems to exist between these three (βα)8-barrel proteins. Consequently, HisA and HisF could be engineered to bind and process the TrpF substrate phosphoribosyl anthranilate (PRA). In both cases, a single aspartate-to-valine substitution was sufficient to establish PRA isomerase activity and the combination with a second aspartate-to-valine exchange significantly improved the turnover number. Since HisA and TrpF operate through an identical acid-base mechanism, the same enzymatic mechanism could be expected for the PRA isomerase activities generated on the HisA and HisF scaffolds. However, while mutational analyses and docking studies revealed a respective general base, no appropriate general acid could be identified. Therefore, the mechanistic foundation of the artificially designed PRA isomerase activity was addressed in the first part of this work.
Initially recorded pH dependences substantiated the mechanistic differences of the naturally occurring and the artificially designed PRA isomerase activity. While TrpF wild-type exhibited the expected bell-shaped pH profile, merely an acidic limb was observed for the investigated HisA variants, suggesting that the hitherto unidentified general acid is rate-limiting for the engineered reaction. A hint on the nature of the catalytic acid was subsequently obtained from the crystal structure of the HisF double mutant with a bound product analogue. The structure suggested that within the enzyme–substrate complex the anthranilic acid moiety of PRA might donate a proton to the furanose ring oxygen of its sugar moiety. This productive geometry of PRA was compared with a non-productive binding mode in molecular dynamics simulations of the HisA variants. In contrast to HisA wild-type, all variants clearly favor an orientation of PRA required for catalysis. Furthermore, the introduced valine residues clearly upshift the pKa value of anthranilic acid to a catalytically useful range. Mixed quantum and molecular mechanics calculations of the HisA double mutant with bound PRA finally demonstrated that an internal proton transfer is also feasible from an energetic point of view and presumably proceeds via a bridging water molecule. In sum, the artificial PRA isomerase activity established on the HisA and HisF scaffolds appears to be partly based on substrate-assisted catalysis and thus mechanistically deviates from the PRA isomerase activity of TrpF.
The second part of this dissertation dealt with the evolution of cellular complexity. Modern organisms are highly developed molecular machineries, which rely on elaborate enzyme systems. There is considerable interest to figure out which degree of enzymatic sophistication had already been reached in the very early phases of biological evolution. Along these lines, substantial progress has been made in the field of ancestral sequence reconstruction, which links computational and evolutionary biology and enables the characterization of extinct proteins. In extreme cases, enzymes from the last universal ancestor of cellular organisms (LUCA) can be studied. The LUCA preceded the diversification into the three domains of life and existed at least 3.5 billion years ago.
Exceptional catalytic features like substrate channeling and allosteric communication are observed in the imidazole glycerol phosphate synthase bi-enzyme complex of the cyclase HisF and the glutaminase HisH. In an attempt to analyze its primal characteristics, we reconstructed a HisF enzyme from the LUCA era (LUCA-HisF). LUCA-HisF could be expressed solubly in Escherichia coli and purified with a high yield. The protein furthermore shows a high thermostability and a folding mechanism comparable to extant (βα)8-barrel enzymes. Accordingly, its subsequently solved crystal structure equals contemporary HisF proteins. Beyond its structural integrity, LUCA-HisF proved to be a highly active and specific enzyme. As its catalytic sophis-tication could only be completely assessed in combination with an interacting gluta-minase, we additionally reconstructed a respective LUCA-HisH sequence. Although both proteins form a stoichiometric complex with high affinity, no catalytic activity could be determined for LUCA-HisH, probably due to uncertainties in the reconstruct-tion process. We instead turned to a complex between LUCA-HisF and the extant HisH enzyme from Zymomonas mobilis. Remarkably, LUCA-HisF could both stimulate the catalytic efficiency of the interacting glutaminase and transport the produced ammonia to its active site via a molecular channel. The evolution of these elaborate features therefore must already have been completed in the LUCA era.
The artificial control of enzymatic activity has been a long-standing goal in the field of protein design. Here, light provides an ideal trigger signal, since it enables a non-invasive and spatiotemporal regulation of biological activity. However, despite various attempts, only few enzymes have been successfully regulated by light so far. Therefore, the design of a light-controllable inhibitor of the (βα)8-barrel enzyme PriA from Mycobacterium tuberculosis (mtPriA) was the aim of the third section of this thesis. Interestingly, the bisubstrate-specific isomerase mtPriA is able to catalyze both the HisA and TrpF reaction and displays a potential target for anti-tuberculosis drugs, since humans can synthesize neither histidine nor tryptophan.
For the construction of the potential inhibitors, two particular features of mtPriA could be harnessed, both of which originate from the molecular evolution from a (βα)4-half-barrel precursor: the protein exhibits a striking twofold rotational symmetry as well as two opposite phosphate binding sites. Consequently, we chose the twofold symmetric, photoswitchable 1,2-dithienylethene (DTE) as a structural core and equipped it with terminal phosphate or phosphonate anchors. The synthesized DTE compounds could reversibly be toggled between a ring-open and ring-closed form by irradiation with UV and visible light, respectively. Both isomers were thermally stable, nearly quantitatively formed and robust over various switching cycles. When tested in steady-state enzyme kinetics, the open isomers of all DTE-phosphates and DTE-phosphonates competitively inhibited the mtPriA activity with the inhibition constants lying in the low micromolar range. Notably, the inhibition activity was lowered up to a factor of eight upon ring-closure, where the enzymatic performance could be directly controlled during catalysis. The different binding affinities obtained upon irradiation seem to be based on a change in the conformational flexibility. Along these lines, molecular dynamics simulations of mtPriA with an inhibitor bound in both isomeric forms demonstrated that the ring-open isomers can readily adapt to the active site of mtPriA. In contrast, due to its restricted mobility, the interaction of the ring-closed form with the enzyme is energetically less favorable. Thus, the dual anchoring of photoswitchable inhibitors constitutes a viable design concept for the reversible regulation of enzymatic activity. The approach may additionally be transferred to other (βα)8-barrel proteins, as phosphate is a frequently encountered element of metabolic substrates.
Translation of the abstract (German)
Die (βα)8-Fass-Struktur ist der am häufigsten vorkommende Faltungstyp unter Enzymen. Durch die räumliche Separation von aktivitäts- und stabilitätsvermittelnden Aminosäuren, sind (βα)8-Fass-Enzyme extrem vielseitig und katalysieren ein breites Spektrum an zellulären Reaktionen. Deswegen stellt dieser besondere Faltungstyp ein ideales Gerüst zur Modifikation katalytischer Aktivität und zur ...
Translation of the abstract (German)
Die (βα)8-Fass-Struktur ist der am häufigsten vorkommende Faltungstyp unter Enzymen. Durch die räumliche Separation von aktivitäts- und stabilitätsvermittelnden Aminosäuren, sind (βα)8-Fass-Enzyme extrem vielseitig und katalysieren ein breites Spektrum an zellulären Reaktionen. Deswegen stellt dieser besondere Faltungstyp ein ideales Gerüst zur Modifikation katalytischer Aktivität und zur Untersuchung enzymatischer Evolutionmechanismen dar.
Gleich mehrere (βα)8-Fass-Enzyme sind am Aminosäuremetabolismus beteiligt. So katalysieren die N’-[(5‘-phosphoribosyl)formimino]-5-aminoimidazol-4-carboxamid ribonucleotid Isomerase (HisA) und die Zyklaseuntereinheit der Imidazolglycerin-phosphat Synthase (HisF) zwei aufeinanderfolgende Schritte in der Histidinbiosynthese. HisA isomerisiert eine Ribosegruppe zu einer Aminoketose, die anschließend von HisF in einer Zykloligase/Lyase-Reaktion gespalten wird. Weiterhin existiert eine zur HisA-Reaktion äquivalente Zuckerisomerisierung innerhalb der Tryptophanbiosynthese – das zuständige Enzym wird TrpF genannt. Die (βα)8-Fass-Proteine HisA, HisF und TrpF scheinen evolutionär verknüpft zu sein, da sie ihre phosphorylierten Substrate durch eine identische Phosphatbindestelle fixieren. So konnte die Umsetzung des TrpF-Substrates Phosphoribosylanthranilat (PRA) sowohl auf dem HisA- als auch auf dem HisF-Gerüst bereits durch den Austausch eines Aspartatrestes zu Valin etabliert werden. In beiden Fällen wurde die PRA-Isomerase-Aktivität durch Kombination mit dem Austausch eines weiteren Aspartatrestes zu Valin deutlich gesteigert. Da die HisA- und TrpF-Reaktion auf dem gleichen Säure-Base-Mechanismus beruhen, konnte ein identischer Reaktionsablauf auch für die auf HisA und HisF erzeugten PRA-Isomerisierungen erwartet werden. Obwohl Mutationsanalysen und Docking-Ansätze zur Identifikation einer entsprechenden katalytischen Base führten, ergaben sich mit diesen Methoden jedoch keine Hinweise auf die allgemeine Säure. Deswegen wurden die mechanistischen Grundlagen der auf den HisA- und HisF-Grundgerüsten etablierten PRA-Isomerase-Aktivität im ersten Teil dieser Arbeit eingehender analysiert.
Dazu wurden zunächst die pH-Abhängigkeiten der neu erzeugten und der natürlich vorkommenden PRA-Isomerase-Aktivität gemessen. Dabei zeigte der TrpF-Wildtyp das erwartete glockenförmige pH-Profil, wohingegen bei den HisA-Varianten lediglich der Säureast beobachtet werden konnte. Die Varianten scheinen demnach einem Reaktionsmechanismus zu folgen, dessen Rate durch eine bis zu diesem Zeitpunkt unbekannte katalytische Säure limitiert wird. Welche Gruppe die Rolle der allgemeinen Säure einnimmt, konnte anschließend mit Hilfe der Kristallstruktur einer HisF-Variante mit gebundenem Produktanalogon näher eingegrenzt werden. Diese Struktur legte den Schluss nahe, dass innerhalb des Enzym-Substrat-Komplexes der Anthranilsäureanteil von PRA ein Proton auf den Furanoseringsauerstoff des Zucker-anteils übertragen könnte. Eine entsprechende Geometrie des Substrates PRA wurde daraufhin in Moleküldynamiksimulationen der HisA-Varianten mit einem unproduktiven Bindungsmodus verglichen. Im Gegensatz zum HisA-Wildtyp, präferierten dabei alle Mutanten die katalytisch produktive Orientierung von PRA. Desweiteren verringern die eingeführten Valin-Reste die Acidität der Anthranilsäure und führen somit zu einer für die Katalyse notwendigen Erhöhung ihres pKa-Wertes. Schließlich zeigten kombinierte quantenmechanische/molekülmechanische Berechnungen der HisA-Doppelmutante mit gebundenem PRA, dass ein Protonentransfer innerhalb des Substrates auch energetisch möglich ist, wobei dafür vermutlich ein verbrückendes Wassermolekül benötigt wird. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die auf den HisA- und HisF-Grundgerüsten künstlich erzeugte PRA-Isomerase-Aktivität zum Teil auf Substrat-vermittelter Katalyse beruht und sich daher von der PRA-Isomerase-Aktivität von TrpF unterscheidet.
Der zweite Teil dieser Dissertation hatte die Evolution zellulärer Komplexität zum Thema. Während moderne Organismen bekanntlich auf ausgeklügelten Enzymsystemen basieren, existieren fast ausschließlich nur theoretische Arbeiten über die Komplexität der Spezies, die in einer sehr frühen Phase der Evolution auftraten. Jedoch wurde durch die kürzlich etablierte Rekonstruktion von Vorläufersequenzen eine Verknüpfung zwischen Bioinformatik und Evolutionsbiologie geschaffen. Mit Hilfe dieser Technik können die Sequenzen nicht mehr existierender Enzyme abgeleitet und damit ihre Eigenschaften charakterisiert werden. Im Extremfall lassen sich so Enzyme des letzten gemeinsamen Vorfahren aller zellulären Organismen (LUCA), aus dem sich vor etwa 3,5 Milliarden Jahren die heutigen Domänen des Lebens entwickelten, untersuchen.
Der Imidazolglycerinphosphat-Synthase-Komplex aus der Zyklase HisF und der Glutaminase HisH zeichnet sich durch bemerkenswerte katalytische Eigenschaften aus. So wird bei Bindung des Liganden an HisF die Glutaminase-Aktivität allosterisch aktiviert und der gebildete Ammoniak durch einen Kanal zum aktiven Zentrum von HisF transportiert. Um die ursprünglichen Eigenschaften der komplexen Synthase HisF zu charakterisieren, wurde ein HisF-Enzym aus dem LUCA-Zeitalter rekonstruiert (LUCA-HisF). Das Protein konnte löslich in Escherichia coli exprimiert und in hohen Ausbeuten gereinigt werden. LUCA-HisF zeigt eine hohe Thermostabilität und sowohl seine Kristallstruktur als auch sein Faltungsmechanismus gleichen rezenten HisF-Proteinen. Darüber hinaus zeigten in vivo-Studien und in vitro-Messungen, dass
LUCA-HisF ein hochaktives und spezifisches Enzym ist. Da seine katalytische Komplexität jedoch nur im Zusammenspiel mit einer interagierenden Glutaminase vollständig analysiert werden konnte, wurde zusätzlich die Sequenz eines entsprechenden LUCA-HisH-Proteins abgeleitet. Obwohl beide Proteine einen stöchio-metrischen und hoch-affinen Komplex ausbilden, erwies sich LUCA-HisH als katalytisch inaktiv, was vermutlich auf einen fehlerbehafteten Rekonstruktionsprozess zurückzuführen ist. Deshalb wurde stattdessen ein Komplex zwischen LUCA-HisF und dem rezenten HisH-Enzym aus Zymomonas mobilis untersucht. Tatsächlich führt die Ligandenbindung an LUCA-HisF zu einer erheblichen Steigerung der Glutaminase-Aktivität, wobei der dadurch erzeugte Ammoniak durch den verbindenden Kanal zum aktiven Zentrum von HisF gelangen kann. Die Evolution dieser komplexen Eigenschaften muss deswegen bereits vor circa 3,5 Milliarden Jahren abgeschlossen gewesen sein.
Die artifizielle Regulation enzymatischer Aktivität ist ein seit Langem bestehendes Ziel auf dem Gebiet des Proteindesigns. Die Steuerung durch Licht ist besonders attraktiv, da sie eine nicht-invasive, räumliche und zeitliche Kontrolle biologischer Aktivität ermöglicht. Trotz zahlreicher Ansätze konnten jedoch bislang nur wenige Enzyme effizient durch Licht reguliert werden. Deswegen wurde im dritten Abschnitt dieser Arbeit ein lichtsteuerbarer Inhibitor des (βα)8-Fass-Enzyms PriA aus Mycobacterium tuberculosis (mtPriA) designt. Die Isomerase mtPriA katalysiert sowohl die HisA- als auch die TrpF-Reaktion und stellt ein potentielles Zielprotein für die Entwicklung von Antituberkulotika dar, weil Menschen weder Histidin noch Tryptophan herstellen können.
Zwei besondere Strukturmerkmale konnten für das Design potentieller mtPriA-Inhibitoren genutzt werden: Aufgrund seiner Evolution aus einem (βα)4-Halbfass-Vorläufer, verfügt mtPriA über eine auffällige zweifache Rotationssymmetrie sowie über zwei gegenüberliegende Phosphatbindestellen. Dementsprechend wurde das zweifach rotationssymmetrische, lichtschaltbare Molekül 1,2-Dithienylethen (DTE) als strukturelles Gerüst der möglichen Inhibitoren verwendet und mit terminalen Phosphat- bzw. Phosphonat-Ankern versehen. Die synthetisierten DTE-Verbindungen konnten durch Bestrahlung mit UV- bzw. sichtbarem Licht reversibel zwischen einem offenen und einem geschlossenem Isomer hin- und hergeschaltet werden. Dieser Zyklus konnte mehrfach wiederholt werden, wobei beide Formen mit hohen Ausbeu-ten gebildet wurden und thermisch stabil waren. Die Verbindungen wurden anschließend in steady-state-Enzymkinetiken charakterisiert. Dabei zeigte sich, dass die offenen Formen aller DTE-Phosphate und -Phosphonate die mtPriA-Aktivität kompetitiv hemmen. Aus den erhaltenen Daten konnten Inhibitionskonstanten im niedrigen mikromolaren Bereich abgeleitet werden. Bemerkenswerterweise zeigten die geschlossenen DTE-Formen bis zu achtfach reduzierte Inhibitionsaktivitäten. Dadurch konnte die enzymatische Umsatzgeschwindigkeit durch Bestrahlung mit UV-Licht unmittelbar während der Katalyse beeinflusst werden. Die ungleichen Bindungsaffinitäten der offenen und geschlossenen Formen basieren vorwiegend auf Unterschieden in der konformationellen Flexibilität. Dementsprechend zeigten Moleküldynamiksimulationen von mtPriA mit gebundenem Inhibitor, dass die offene Form sich ohne Weiteres an das aktive Zentrum anpassen kann. Im Gegensatz dazu ist das geschlossene Isomer erheblich in seiner Beweglichkeit eingeschränkt, was zu einer energetisch ungünstigeren Interaktion mit der enzymatischen Bindetasche führt. Die doppelte Verankerung von lichtschaltbaren Inhibitoren scheint daher ein erfolgreiches Designkonzept zur reversiblen Steuerung enzymatischer Aktivität darzustellen. Der hier beschriebene Ansatz kann im Prinzip auch auf weitere (βα)8-Fass-Enzyme übertragen werden, da Phosphat ein weit verbreiteter Baustein metabolischer Substrate ist.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 01:15
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