Plank, Nicole
(2016)
Dimeric histamine H2 receptor agonists as molecular tools and genetically engineered HEK293T cells as an assay platform to unravel signaling pathways of hH1R and hH2R.
PhD, Universität Regensburg.
Date of publication of this fulltext: 02 May 2016 12:52
Abstract (English)
Previously, our workgroup applied the bivalent ligand approach for the H2R by linking two acylguanidine moieties. This led to highly potent and selective H2R agonists. However, the acylguandines turned out to decompose upon long-term storage in aqueous solution, in particular under alkaline conditions. Based on this preceding work, the medicinal chemistry part of this thesis deals with the ...
Abstract (English)
Previously, our workgroup applied the bivalent ligand approach for the H2R by linking two acylguanidine moieties. This led to highly potent and selective H2R agonists. However, the acylguandines turned out to decompose upon long-term storage in aqueous solution, in particular under alkaline conditions. Based on this preceding work, the medicinal chemistry part of this thesis deals with the synthesis of stable bivalent H2R agonists in which the acylguanidine group was replaced by a bioisosteric carbamoylguanidine moiety. With respect to studying the mode and stoichiometry of binding of such bivalent compounds, the synthesis of a chain-branched dimeric ligand, enabling radio- and fluorescence labeling was considered.
The prepared compounds were investigated in GTPγS binding assays on recombinant human and guinea pig H2R and by radioligand competition binding on human H1, H2, H3 and H4 receptors expressed in Sf9 insect cells. Moreover, representative compounds were studied on human monocytes, with regard to cAMP formation and the inhibition of fMLP induced reactive oxygen species.
The bivalent carbamoylguanidine-type H2R ligands proved to be high affinity H2R agonists, equipotent with the corresponding carba analogs, the acylguanidines. Achieving up to 2500 times the potency of histamine, these compounds are among the most potent H2R agonists known so far. Unlike the imidazole-type compounds, the bioisosteric aminothiazoles proved to be selective for the H2R over the other histamine receptor subtypes. Although the “cold” version of a synthesized propionamide derivative proved to be a potent and selective H2R agonist, the corresponding tritiated analog, due to a high degree of unspecific binding, was not applicable to saturation binding studies, making the determination of the number of binding sites impossible. Unfortunately, the fluorescently labeled ligands entered the cells in an H2R-independent manner.
In human monocytes the investigated compounds induced cAMP accumulation and inhibited the fMLP-induced ROS production in a highly potent manner so that such compounds represent a good starting point for the development of selective H2R drugs for the treatment of AML.
The bioisosteric and bivalent approach led to highly potent, selective and stable H2R agonists that proved to be useful pharmacological tools for functional studies on recombinant receptors and native cells. Regarding the bioanalytical and toxicological properties of the bivalent ligands, compounds bearing a short spacer should be preferred for future in-vivo studies.
The second part of this work aimed at the establishment of cell-based functional assays for the discrimination between alternative signaling pathways activated by HxR stimulation. For this purpose, HEK293T CRE Luc cells were stably transfected with the cDNA encoding the hH1R or the hH2R, respectively. The transfectants were investigated in a luciferase reporter gene assay, in a fura-2 assay and in an aequorin assay. Moreover, a TR-FRET based cAMP assay was applied.
The activation of the H1R led to an increase in the transcription of luciferase. In the presence of the selective Gαq inhibitor UBO-QIC the luciferase expression was reduced, whereas in combination with UBO-QIC and PKA inhibitors (Rp-cAMP-S or Rp-8-Br-cAMP-S) the luciferase activity was almost completely inhibited. The data obtained from the luciferase reporter gene assay suggested that the luciferase expression, mediated by the H1R, was at least in part mediated by cAMP. Furthermore, it was shown that cells preincubated with UBO-QIC were no longer capable of triggering a Ca2+ signal in the aequorin assay, upon activation of the H1R. Detection of a cAMP signal failed most probably due to a low signal-to-noise ratio, hence it should be taken into consideration that the activation of the hH1R is associated with additional pathways.
The H2R revealed high constitutive activity in the luciferase reporter gene assay, probably due to a high expression level of the receptor in the cells. In the presence of UBO-QIC the luciferase activity was reduced. Additionally, it was shown in both Ca2+ assays that the activation of the H2R led to a Gαq mediated Ca2+ response.
The data indicate that, regardless of preferential coupling of hH1R and hH2R to Gαq and Gαs, respectively, both receptors are capable of triggering differential signaling pathways, at least in genetically modified cells. In general, the stably co-transfected HEK293T CRE Luc cells represent a powerful pharmacological toolkit for:
- The identification of alternative signaling pathways.
- The investigation of GPCRs and the pharmacological characterization of functionally selective ligands.
- The deconvolution of signals from label-free assays.
Translation of the abstract (German)
Kürzlich wurden von unserer Arbeitsgruppe bivalente Histamin-H2-Rezeptor (H2R) Liganden, die zwei N(G) acylierte Heteroarylpropylguanidin-Partialstrukturen enthalten, beschrieben. Diese Verbindungen sind hochpotente und selektive H2R Agonisten. Es stellte sich allerdings heraus, dass diese Acylguanidine bei der Lagerung in Lösung, vor allem unter basischen Bedingungen, zur Hydrolyse neigen. ...
Translation of the abstract (German)
Kürzlich wurden von unserer Arbeitsgruppe bivalente Histamin-H2-Rezeptor (H2R) Liganden, die zwei N(G) acylierte Heteroarylpropylguanidin-Partialstrukturen enthalten, beschrieben. Diese Verbindungen sind hochpotente und selektive H2R Agonisten. Es stellte sich allerdings heraus, dass diese Acylguanidine bei der Lagerung in Lösung, vor allem unter basischen Bedingungen, zur Hydrolyse neigen. Basierend auf diesen Vorarbeiten handelt der medizinisch-chemische Teil der vorliegenden Dissertation von der Synthese und Charakterisierung stabiler bivalenter H2R Agonisten, in denen die Acylguanidingruppe durch eine bioisostere Carbamoylguanidingruppe ersetzt wurde. Um die Art und die Stöchiometrie der Bindung der bivalenten Liganden genauer zu untersuchen, wurde ein verzweigter bivalenter Ligand synthetisiert, der es ermöglichte, Fluoreszenzliganden und einen Radioliganden herzustellen.
Die synthetisierten Verbindungen wurden im GTPγS Assay an rekombinanten H2R des Menschen (h) und des Meerschweinchens (gp) und in Bindungsstudien an humanen H1, H2, H3 und H4 Rezeptoren charakterisiert. Weiterhin wurden in Kooperation mit der Medizinischen Hochschule Hannover zwei repräsentative Verbindungen an humanen Monozyten hinsichtlich cAMP Produktion und Inhibition der fMLP induzierten Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) untersucht.
Die bivalenten H2R Liganden vom Carbamoylguanidintyp erwiesen sich als hoch affine, in ihrer Potenz den entsprechenden Acylguanidinen vergleichbare H2R Agonisten. Die potenteste Verbindung erreichte eine ca. 2500-fach höhere Potenz als Histamin und gehört somit zu den stärksten derzeit bekannten H2R Agonisten. Im Gegensatz zu Verbindungen mit Imidazolring erwiesen sich die bioisosteren Aminomethylthiazole als selektiv für den H2R. Die hohe Potenz der H2R Agonisten wurde an humanen Monozyten anhand der Steigerung der intrazellulären cAMP Konzentration und der Hemmung der fMLP induzierten ROS Bildung bestätigt.
Die Anwendung von Bioisosteriekonzepten führte in Verbindung mit „Pharmakophorverdoppelung“ zu hochpotenten, selektiven und stabilen H2R Agonisten, die sich als wertvolle pharmakologische Werkzeuge für funktionelle Studien an rekombinanten Systemen und nativen Zellen erwiesen. Solche Verbindungen könnten eine Basis für die Entwicklung selektiver Arzneistoffe zur Behandlung der akuten myeloischen Leukämie darstellen.
Während die „kalte“ Version eines Propionamid-Derivats einen potenten und selektiven H2R Agonisten darstellte, erwies sich die synthetisierte tritiierte Form überraschenderweise aufgrund hoher unspezifischer Bindung als ungeeignet für Bindungsstudien. Die synthetisierten Fluoreszenzliganden wurden H2R-unabhängig in die Zellen aufgenommen.
Das zweite Ziel dieser Arbeit bestand in der Etablierung zellbasierter funktioneller Assays zur Identifizierung alternativer Signalwege des H1R und des H2R. Zu diesem Zweck wurden humane H1R und H2R in HEK293T CRE Luc Zellen exprimiert. Diese stabil transfizierten Zellen wurden in verschiedenen Testsystemen (Luciferase Genreporter Assay, Fura-2 und Aequorin Assay) untersucht. Weiterhin wurde eine cAMP Bestimmungsmethode, basierend auf dem TR-FRET Prinzip, angewandt.
Die Aktivierung des H1R führte zu einem Anstieg der Transkription der Luciferase. In Gegenwart des selektiven Gαq Inhibitors UBO-QIC wurde die Expression der Luciferase zwar reduziert aber nicht vollständig gehemmt. Bei gleichzeitiger Hemmung des Gαq Proteins und der PKAI und PKAII war fast keine Luciferaseaktivität mehr messbar.
Die Ergebnisse des Luciferase Genreporter Assays deuten darauf hin, dass die H1R vermittelte Expression der Luciferase zum Teil cAMP vermittelt ist. Weiterhin waren mit UBO-QIC vorinkubierte Zellen nicht mehr in der Lage, nach H1R Aktivierung ein Calciumsignal im Aequorin Assay auszulösen. Eine Steigerung der intrazellulären cAMP Konzentration ließ sich nicht messen, vermutlich aufgrund eines sehr niedrigen Signal-Rausch-Verhältnisses. Zusammenfassend sprechen diese Ergebnisse dafür, dass die Stimulation des H1R in dem verwendeten zellulären System zur Aktivierung alternativer Signalwege führt.
Der H2R zeigte hohe konstitutive Aktivität im Luciferase Reportergen Assay, vermutlich aufgrund einer sehr hohen Rezeptorexpression. Interessanterweise reduzierte UBO-QIC die Luciferaseaktivität. Zudem führte die H2R Aktivierung, in beiden Ca2+ Assays, zu einem Gαq vermittelten Ca2+ Signal.
Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass, abgesehen von der bevorzugten Kopplung des H1R an Gαq und des H2R an Gαs, beide Rezeptoren, zumindest in genetisch modifizierten Zellen, in der Lage sind, unterschiedliche Signalwege zu aktivieren.
Die genetisch modifizierten HEK293T CRE Luc Zellen sind ein nützlicher pharmakologischer „Baukasten“ für
- die Identifizierung alternativer Signalwege.
- die Untersuchung von GPCRs und die Identifizierung von funktionell selektiven Liganden.
- die Dekonvolution komplexer Signalen aus markierungsfreien Assays.
Export bibliographical data
Download Statistics