| License: Publishing license for publications excluding print on demand (14MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-330227
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.33022
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 18 December 2015 |
| Referee: | Prof. Dr. Achim Göpferich and PD Dr. Rainer Müller |
| Date of exam: | 9 October 2015 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmaceutical Technology (Prof. Göpferich) |
| Keywords: | Hydrogele, Diels-Alder, Drug Delivery, Auge, Antikörper |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 500 Natural sciences & mathematics 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine 600 Technology > 615 Pharmacy |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 33022 |
Abstract (English)
This thesis is focused on the development and characterization of Diels Alder hydrogels as injectable drug delivery system for the intraocular application of antibodies. Currently, hydrogels are already used for a number of different applications in ophthalmology. For instance, they are used as in situ gelling eye drops, soft contact lenses, intraocular lenses and adhesives for ocular wound ...
Abstract (English)
This thesis is focused on the development and characterization of Diels Alder hydrogels as injectable drug delivery system for the intraocular application of antibodies.
Currently, hydrogels are already used for a number of different applications in ophthalmology. For instance, they are used as in situ gelling eye drops, soft contact lenses, intraocular lenses and adhesives for ocular wound repair or are investigated as vitreous substitutes and intravitreal drug delivery systems (Chapter 2). Although significant progress has been made in the field of soft contact lenses, in situ gelling eye drops and adhesives for ocular wound repair, many challenges remain to improve the safety and clinical performance of intraocularly applied hydrogels. More research is particularly needed to improve hydrogels as intravitreal drug delivery systems for the treatment of severe, vision-threatening diseases, such as age-related macular degeneration or proliferative diabetic retinopathy.
There are a number of general requirements that intraocularly applied hydrogels must fulfill. Ideally, these hydrogels are injectable and offer sustained drug release over several weeks. So-called in situ gelling hydrogels, which are injected prior to gelation and form a semi-solid drug depot at the application site, offer such characteristics. After gelation the mechanical properties of the resulting hydrogel should be comparable to those of the environment in order to cause no foreign body sensation. Moreover, the hydrogel should be designed for simple and effective drug loading procedures, especially for proteins and antibodies. Therefore, suitable cross-linking processes are necessary to permit fast gelation without inactivating the entrapped proteins. Besides appropriate loading procedures, a complete, yet sustained release of still active drugs is of particular importance. One of the main challenges of hydrogels is the control of drug release over several weeks due to their high water content. After complete drug release, the hydrogel should degrade without releasing any toxic degradation product. Although, a multitude of polymers and cross-linking possibilities have already been tested, there is no product commercially available until today. Promising materials are chemically cross-linked PEG-based hydrogels. Due to their excellent biocompatibility they are used for several biomedical applications. As in situ gelling systems they can be easily injected by minimally invasive techniques and hold great promise as drug delivery systems. Nevertheless, most established cross-linking mechanisms are associated with significant disadvantages, such as the formation of potentially harmful radicals or unwanted side reactions with incorporated protein drugs.
To overcome these limitations, new cross-linking reactions for PEG-based hydrogels have to be developed. Since the Diels-Alder reaction proceeds in water without any initiator or metal catalyst, it is considered as an effective and non-toxic cross-linking possibility (Chapter 3). For the hydrogel preparation, two complementary macromonomers were synthesized by functionalizing star-shaped PEG with furyl and maleimide groups.
The influence of the macromonomer concentration, molecular weight and branching factor on gel characteristics, such as rheology and swelling behavior, were investigated. Surprisingly, the covalently cross-linked hydrogels dissolved within days to weeks. To investigate this unexpected degradation behavior of PEG-based Diels-Alder hydrogels in detail, further experiments were performed (Chapter 4). UV spectroscopy was used to analyze the hydrolytic stability of maleimide functionalized star-shaped PEG as a function of temperature and pH. Finally, molecular modeling studies of Diels-Alder and retro-Diels-Alder moieties were performed to investigate the influence of these reactions for the degradation process.
Besides the degradability, the permeability of entrapped drugs, such as proteins or antibodies, is crucial for success or failure of the system. The mesh size or correlation length is an important parameter that characterizes the permeability. It is defined as “the average distance between consecutive cross-links” and indicates the maximum size of solutes that can pass through the gel network. In Chapter 5 swelling studies, rheology and low field NMR spectroscopy were used to calculate the mesh size of the prepared Diels-Alder hydrogels. The knowledge of the mesh size, in combination with the size of the entrapped molecule, allows the estimation of the drug release rate and the evaluation of the general suitability of the resulting hydrogels for controlled release of entrapped, therapeutic antibodies. As a proof of concept, fluorescein-labeled dextrans of different molecular weight were entrapped into the hydrogel and release studies were performed. Finally, the data of those in vitro studies were compared to theoretical predictions.
However, slow gelation and comparatively fast degradation may limit the application of Diels-Alder hydrogels as injectable drug delivery systems. To overcome these limitations the macromonomers were modified with lysine and/or 6-aminohexanoic acid residues in order to increase the hydrolytic stability of maleimide and to double the number of reactive groups per macromonomer (Chapter 6).
To prove the feasibility of the optimized Diels-Alder hydrogels as drug delivery systems, the gels were loaded with bevacizumab, a vascular endothelial growth factor-neutralizing antibody used in the treatment of age-related macular degeneration. Afterwards, the release profiles of the entrapped antibody were determined by fluorescence spectroscopy.
Translation of the abstract (German)
Die Entwicklung und Charakterisierung von Diels-Alder-Hydrogelen als injizierbare Freisetzungssysteme für die intraokulare Anwendung von Antikörpern steht im Fokus dieser Arbeit. Hydrogele werden bereits für eine Reihe von verschiedenen Anwendungen in der Augenheilkunde verwendet. Beispielsweise werden sie als in-situ-gelierende Augentropfen, weiche Kontaktlinsen, Intraokularlinsen oder ...
Translation of the abstract (German)
Die Entwicklung und Charakterisierung von Diels-Alder-Hydrogelen als injizierbare Freisetzungssysteme für die intraokulare Anwendung von Antikörpern steht im Fokus dieser Arbeit.
Hydrogele werden bereits für eine Reihe von verschiedenen Anwendungen in der Augenheilkunde verwendet. Beispielsweise werden sie als in-situ-gelierende Augentropfen, weiche Kontaktlinsen, Intraokularlinsen oder Klebstoffe für die okulare Wundheilung eingesetzt. Untersucht wird zudem ihre Anwendung als Glaskörperersatz oder intravitreales Freisetzungssystem (Kapitel 2). Obwohl bereits erhebliche Fortschritte im Bereich der weichen Kontaktlinsen, in-situ-gelierenden Augentropfen und Klebstoffe für die okulare Wundheilung gemacht worden sind, bleiben viele Herausforderungen um die Sicherheit und das klinische Verhalten intraokular angewendeter Hydrogele zu verbessern. Mehr Forschung ist vor allem notwendig, um Hydrogele als intravitreale Freisetzungssysteme für die Behandlung von schwerwiegenden Erkrankungen, wie der altersbedingten Makuladegeneration oder der proliferativen diabetischen Retinopathie, zu verbessern.
Es gibt eine Reihe von allgemeinen Anforderungen, die intraokular angewendete Hydrogele erfüllen müssen. Idealerweise sind diese Hydrogele injizierbar und gewährleisten eine verzögerte Wirkstoffabgabe über mehrere Wochen. Sogenannte in-situ-gelierende Hydrogele, welche vor der Gelierung injiziert werden und am Applikationsort ein halbfestes Arzneimitteldepot ausbilden, bieten diese Eigenschaften. Nach der Gelierung sollten die mechanischen Eigenschaften des resultierenden Hydrogels vergleichbar mit denen der Umgebung sein, um kein Fremdkörpergefühl zu verursachen. Darüber hinaus sollte das Hydrogel für ein einfaches und effektives Verfahren zur Wirkstoffbeladung, insbesondere für Proteine und Antikörper, entwickelt werden. Deshalb sind Vernetzungsprozesse erforderlich, welche eine schnelle Gelierung ohne Inaktivierung der eingeschlossenen Proteine ermöglichen. Neben geeigneten Beladungsverfahren ist eine vollständige, aber anhaltende Freisetzung von wirksamen Arzneistoffen von besonderer Bedeutung. Die größte Herausforderung ist jedoch die kontrollierte Steuerung der Wirkstofffreisetzung über mehrere Wochen trotz des hohen Wassergehaltes der Hydrogele. Nach vollständiger Wirkstofffreisetzung sollte das Hydrogel letztendlich ohne die Freisetzung toxischer Spaltprodukte abgebaut werden. Obwohl eine Vielzahl von Polymeren und Vernetzungsmöglichkeiten bereits getestet worden ist, gibt es bis heute kein kommerziell erhältliches Produkt. Die vielversprechendsten Materialien sind chemisch quervernetzte Hydrogele auf Basis von Polyethylenglykol. Aufgrund ihrer ausgezeichneten Bioverträglichkeit werden sie bereits für vielfältige biomedizinische Anwendungen eingesetzt. Als in-situ-gelierende Systeme können sie leicht durch minimalinvasive Techniken injiziert und als Freisetzungssysteme verwendet werden. Gleichwohl sind die meisten etablierten Quervernetzungsmechanismen mit erheblichen Nachteilen, wie der Bildung von potentiell schädlichen Radikalen oder unerwünschten Nebenreaktionen mit eingeschlossenen Proteinen und Wirkstoffen, verbunden. Um diese Einschränkungen zu bewältigen, müssen neue Quervernetzungsreaktionen für Polyethylenglykol-Hydrogele entwickelt werden. Eine effektive und atoxische Quervernetzungsmöglichkeit stellt dabei die Diels-Alder-Reaktion dar, da sie in Wasser ohne die Verwendung von Initiatoren oder Metallkatalysatoren abläuft (Kapitel 3). Für die Herstellung von Diels-Alder-Hydrogelen wurden zwei komplementäre Makromonomere durch Funktionalisierung von sternförmigem Polyethylenglykol mit entweder Furyl- oder Maleimidgruppen synthetisiert. Der Einfluss von Konzentration, Molekulargewicht und Verzweigungsfaktor des Makromonomers auf Geleigenschaften, wie das Fließ- und Quellungsverhalten, wurde untersucht.
Überraschenderweise lösten sich die kovalent vernetzten Hydrogele innerhalb von Tagen bis Wochen auf. Um dieses unerwartete Abbauverhalten der Diels-Alder-Hydrogele im Detail zu untersuchen, wurden weitere Experimente durchgeführt (Kapitel 4). Die hydrolytische Stabilität von Maleimid-funktionalisiertem, sternförmigem Polyethylenglykol in Abhängigkeit von Temperatur und pH-Wert wurde mittels UV-Spektroskopie ermittelt. Molekulare Modellierungen wurden durchgeführt um die Bedeutung der Diels-Alder- und Retro-Diels-Alder-Reaktion für den Abbauprozess zu untersuchen.
Neben der Abbaubarkeit der Hydrogele ist die Permeabilität von eingeschlossenen Wirkstoffen, wie Proteinen oder Antikörpern, entscheidend für den Erfolg oder Misserfolg des Systems. Ein wichtiger Parameter, der die Permeabilität auszeichnet, ist die Maschenweite oder Korrelationslänge. Sie wird als der „durchschnittliche Abstand zwischen aufeinanderfolgenden Querverbindungen“ definiert und gibt die maximale Größe der gelösten Stoffe an, die durch das Gelnetzwerk diffundieren können. In Kapitel 5 wurden Quellungsstudien, Rheologie und Niederfeld-NMR-Spektroskopie verwendet, um die Maschenweite der Diels-Alder-Hydrogele zu bestimmen. Die Kenntnis über die Maschenweite, in Kombination mit der Größe des eingeschlossenen Moleküls, ermöglicht eine theoretische Abschätzung der Freisetzungsrate und die Bewertung, ob die betrachteten Hydrogele als Freisetzungssysteme geeignet sind. Anschließend wurden Hydrogele in in-vitro-Studien mit Fluorescein-markierten Dextranen unterschiedlichen Molekulargewichtes beladen und die Freisetzungseigenschaften mit den theoretischen Vorhersagen verglichen.
Allerdings können eine langsame Gelierung und ein vergleichsweise schneller Abbau die Anwendung der Diels-Alder-Hydrogele als injizierbare Wirkstoffabgabesysteme begrenzen. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden die Makromonomere mit Lysin und/oder 6-Aminohexansäure modifiziert, um die hydrolytische Stabilität des Maleimids zu erhöhen und die Anzahl der reaktiven Gruppen pro Makromonomer zu verdoppeln (Kapitel 6). Zur Überprüfung der Eignung dieser optimierten Diels-Alder-Hydrogele als Freisetzungssysteme, wurden die Gele mit Bevacizumab beladen, einem Antikörper gegen den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor, welcher unter anderem in der Therapie der altersabhängigen Makuladegeneration eingesetzt wird. Die Freisetzungsprofile des eingeschlossenen Antikörpers wurden mittels Fluoreszenzspektroskopie bestimmt.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 23:20
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