| License: Creative Commons Attribution No Derivatives 4.0 (11MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-354126
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.35412
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 27 March 2017 |
| Referee: | Prof. Dr. Ralf Wagner |
| Date of exam: | 7 February 2017 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene |
| Keywords: | HIV-1, Gag, T cell vaccine, CD8 T cell, Virus-like particles, Vaccine design, epitopes |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 500 Natural sciences & mathematics 500 Science > 570 Life sciences 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 35412 |
Abstract (English)
Control of disease progression in certain HIV-1 infected individuals is often associated with CD8+ T cell responses directed towards Gag-derived epitopes presented on HLA class I molecules. This indicates that such responses play a crucial role in combating virus replication. However, both the large variability of HIV-1 and the diversity of HLA alleles impose a challenge on the elicitation of ...
Abstract (English)
Control of disease progression in certain HIV-1 infected individuals is often associated with CD8+ T cell responses directed towards Gag-derived epitopes presented on HLA class I molecules. This indicates that such responses play a crucial role in combating virus replication. However, both the large variability of HIV-1 and the diversity of HLA alleles impose a challenge on the elicitation of protective CD8+ T cell responses by vaccination.
To address this problem, an algorithm was conceived to generate Gag antigens enriched with patient-derived CD8+ T cell epitopes. Since the function of Gag to produce virus-like particles (VLPs) was deemed important for priming of an adequate CD8+ T cell response, the program excluded all epitopes with budding-deleterious properties. To achieve this, all amino acid substitutions (AAS) that had been identified in the epitope set through mapping them to a Gag reference sequence, were assessed using a trained classifier that considers structural-energy- and sequence-conservation-based features to predict whether each AAS is compatible with budding. These predictions were validated experimentally for over 100 variants, showing a precision of 100% regarding classification of budding competence. Next, epitopes that contain only budding-retaining AAS were assigned a score that considers various customizable epitope-specific properties, like frequencies of HLA class I molecules presenting the epitope in a given population, subtype affiliation, and conservation status. Using a genetic algorithm, as many compatible epitopes as possible were combined into a novel Gag antigen sequence, aiming to maximize their cumulative score. After each round of antigen generation, all previously integrated epitopes were eliminated from the input data set. Thus, in subsequent rounds only the remaining epitopes were used, which resulted in a set of complementary antigens. To evaluate the performance of the algorithm, a trivalent set of globally applicable CD8+ T cell epitope-enriched Gag antigens (teeGags1-3) was generated and computationally validated in this thesis. It could be shown that the teeGags are superior to any known, naturally found or in silico generated Gag sequence from previously published work regarding the number and quality of epitopes, as well as the population coverage, defined as the average number of epitopes presented per person. The shape and size of teeGag VLPs were examined biochemically and wildtype-like characteristics were observed for teeGag1 and teeGag3. teeGag2, however, exhibited some aberrant, tubular structures and slightly larger particles, probably due to a set of mutations within the p2 region of Gag. To characterize the increased immunological breadth of the teeGags, a method to directly identify HLA-class-I-presented epitopes was conceived. For this, the conditioned supernatant from cells that produce soluble forms of HLA (sHLA) was used for HLA-affinity chromatography. Peptides from the isolated sHLA complexes were further purified and employed for sequencing through LC-MS/MS analysis. It was shown in this thesis that this method can be used to identify sHLA-restricted peptides. However, the sensitivity has to be further increased to allow examination of the immunological breadth of antigens.
In conclusion, with the in silico validated enhanced immunological breadth and the biochemically verified structural conservation, the presented designer teeGags qualify as next-generation vaccine antigens that potentially elicit superior CD8+ T cell responses.
Translation of the abstract (German)
Bei bestimmten HIV-1 infizierten Personen, welche den Krankheitsverlauf weitgehend kontrollieren können, ist eine solche Kontrolle häufig verbunden mit CD8+ T-Zell Antworten gegen Gag-spezifische Epitope, welche auf HLA Klasse I Molekülen präsentiert werden. Dies deutet darauf hin, dass solche Antworten bei der Inhibition der Virusreplikation eine entscheidende Rolle einnehmen. Bei der ...
Translation of the abstract (German)
Bei bestimmten HIV-1 infizierten Personen, welche den Krankheitsverlauf weitgehend kontrollieren können, ist eine solche Kontrolle häufig verbunden mit CD8+ T-Zell Antworten gegen Gag-spezifische Epitope, welche auf HLA Klasse I Molekülen präsentiert werden. Dies deutet darauf hin, dass solche Antworten bei der Inhibition der Virusreplikation eine entscheidende Rolle einnehmen. Bei der Entwicklung von Vakzinierungsstrategien, die solche protektiven CD8+ T-Zell Antworten hervorrufen sollen, stellen jedoch sowohl die enorme HIV-1 Variabilität, als auch die Diversität von HLA Allelen eine Herausforderung dar.
Um diese Probleme zu adressieren, wurde ein Algorithmus zur Generierung von Gag Antigenen konzipiert, welche mit bei Patienten gefundenen CD8+ T-Zell Epitopen angereichert sind. Da die Gag spezifische Eigenschaft, Virus-ähnliche Partikel (virus-like particles - VLPs) zu produzieren, als wichtig für das Ausbilden einer adäquaten CD8+ T-Zell Antwort angesehen wird, entfernt das Programm zusätzlich alle Epitope mit negativen Einflüssen auf die Partikel Freisetzung (budding). Um dies zu erreichen, wurden alle Aminosäure Substitutionen (amino acid substitutions - AAS), welche im Epitop-Set durch Vergleich mit einer Gag Referenz-Sequenz identifiziert wurden, durch einen trainierten Klassifikator bewertet. Dieser zieht sowohl strukturbasierte Energiefunktionen, als auch sequenzbasierte Konservierungseigenschaften heran, um vorherzusagen ob einzelne AAS mit der Freisetzung von Partikeln kompatibel sind. Diese Vorhersagen wurden experimentell für mehr als 100 Varianten getestet, wobei ein positiver prädiktiver Wert bezüglich der Klassifizierung auf Erhalt der Partikel-Freisetzung von 100% erreicht wurde. Im nächsten Schritt wurde allen Epitopen, die nur AAS enthalten, welche die Partikel-Freisetzung nicht negativ beeinflussen, ein Score zugeordnet. Dieser Score berücksichtigt verschiedene individualisierbare, Epitop-spezifische Eigenschaften, wie Frequenzen von HLA Klasse I Molekülen, welche das Epitop präsentieren können, Subtyp-Zugehörigkeit und Konservierungsgrad. Mithilfe eines genetischen Algorithmus wurden anschließend möglichst viele kompatible Epitope zu einer neuartigen Gag-Antigensequenz kombiniert, mit dem Ziel den kumulativen Score zu maximieren. Nach jeder Antigengenerierungsrunde wurden alle dabei verwendeten Epitope aus dem Eingangsdatensatz entfernt. Dadurch wurden in den darauffolgenden Runden nur die übriggebliebenen Epitope verwendet, was in einem Set von zueinander komplementären Antigenen resultiert. Um die Leistungsfähigkeit dieses Algorithmus zu evaluieren, wurde in dieser Doktorarbeit ein mit CD8+ T-Zell Epitopen angereichertes, für die globale Anwendung gedachtes, trivalentes Set von HIV-1-Gag Antigenen (teeGags1-3) generiert und computergestützt validiert. Dabei konnte gezeigt werden, dass die teeGags bezüglich Anzahl und Qualität der enthaltenen Epitope, als auch bezüglich der Populationsabdeckung, definiert als die durchschnittliche Anzahl an Epitopen pro Person, besser sind als jede bekannte, natürlich vorkommende oder in silico generierte Gag-Sequenz aus bereits veröffentlichten Arbeiten. Die Form und Größe der teeGag VLPs wurden biochemisch untersucht, wobei für teeGag1 und teeGag3 Wildtyp ähnliche Charakteristika beobachtet wurden. teeGag2 jedoch wies einige anomale, tubuläre Strukturen und etwas vergrößerte Partikel auf. Diese Veränderungen gehen wahrscheinlich auf ein Set von in der p2 Region von Gag eingeführten Mutationen zurück. Um die potentiell verbesserte immunologische Breite der teeGags zu charakterisieren, wurde eine Methode zur direkten Identifizierung von auf HLA-Klasse-I präsentierten Epitopen entwickelt. Dafür wurde der Kulturüberstand von Zellen, welche eine lösliche Variante von HLA Molekülen (sHLA) produzieren für eine HLA-Affinitätschromatographie verwendet. Die Peptide der isolierten sHLA Komplexe wurden weiter aufgereinigt und anschließend mittels LC-MS/MS Analyse sequenziert. Es konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass diese Methode verwendet werden kann, um sHLA-restringierte Peptide zu identifizieren, allerdings muss die Sensitivität noch weiter verbessert werden, um die immunologische Breite von Antigenen untersuchen zu können.
Zusammenfassend qualifizieren die vorgestellten, neuartig designten teeGags aufgrund ihrer in silico validierten immunologischen Breite und des biochemisch bestätigten Erhalts der Struktur als Impfstoffantigene der nächsten Generation, um potentiell bessere CD8+ T-Zell Antworten hervorrufen.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 21:28
Owner only: item control page
Download Statistics