| License: Creative Commons Attribution 4.0 (15MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-355085
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.35508
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 3 April 2017 |
| Referee: | Prof. Dr. Armin Buschauer and Prof. Dr. Günther Bernhardt |
| Date of exam: | 3 April 2017 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmaceutical/Medicinal Chemistry II (Prof. Buschauer) |
| Keywords: | muscarinic receptor, heterodimeric ligands, fluorescent ligands |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 35508 |
Abstract (English)
In humans, the family of muscarinic acetylcholine receptors (mAChR, MRs) comprises five subtypes (M1R-M5R), which are members of the class A GPCR superfamily and mediate the action of the neurotransmitter acetylcholine in the central and peripheral nervous system. For instance, the M2R, which binds to Gi/o heterotrimeric G-proteins, acts as a presynaptic autoreceptor in the brain and in the ...
Abstract (English)
In humans, the family of muscarinic acetylcholine receptors (mAChR, MRs) comprises five subtypes (M1R-M5R), which are members of the class A GPCR superfamily and mediate the action of the neurotransmitter acetylcholine in the central and peripheral nervous system. For instance, the M2R, which binds to Gi/o heterotrimeric G-proteins, acts as a presynaptic autoreceptor in the brain and in the periphery. Accordingly, selective M2R antagonism in the CNS, resulting in enhanced cholinergic transmission, was suggested as an approach to increase cholinergic function in Alzheimer patients. MRs represent important drug targets, however, there is still a need for highly subtype selective MR ligands, as the development of selective agents has been challenging due to the high conservation of the acetylcholine (orthosteric) binding site. Due to the less conserved allosteric binding sites, the dualsteric ligand approach, i.e. the design of compounds, which simultaneously address the orthosteric and allosteric binding sites, is considered a promising strategy to develop MR ligands with improved subtype selectivity.
This work was aiming at the synthesis and pharmacological characterization of dibenzodiazepinone-type heterodimeric MR ligands, which were prepared by linking different monomeric MR ligands (agonists, antagonists, orthosteric and allosteric ligands) through various linkers to a pharmacophoric moiety derived from the dibenzodiazepinone DIBA. The synthesis afforded heterodimeric ligands (‘DIBA-xanomeline’, ‘DIBA-TBPB’, ‘DIBA-77-LH-28-1’, ‘DIBA-propantheline’ and ‘DIBA-4-DAMP’) and ‘DIBA-DIBA’-type homodimeric ligands. Equilibrium competition binding studies with [3H]NMS at live CHO cells expressing the respective human MxR subtype (x = 1-5) revealed a M2R preference of all dimeric ligands with high M2R affinities (Ki values: 0.08-5.8 nM). These data demonstrated that the type of the linker (short vs. long, basic vs. non-basic, etc.) and the type of the second pharmacophoric group had only little impact on M2R binding. As non-DIBA-type monomeric and homodimeric reference compounds exhibited considerably lower M2R affinities than the synthesized DIBA-derived ligands, the high M2R affinity of the heterodimeric dibenzodiazepinone-type ligands is most likely conferred by the ‘dibenzodiazepinone’ pharmacophore.
Two tritium-labeled DIBA-derived heterodimeric ligands (‘DIBA-xanomeline’- and DIBA-TBPB’-type) were prepared and characterized by saturation and kinetic binding studies at the hM2¬R. Saturation binding experiments showed that these ligands address the orthosteric site of the M2R. The ‘DIBA-TBPB’-type dimeric radioligand ([3H]115) exhibited a very high M2R affinity (Kd value 0.13 nM). The investigation of the effect of allosteric MR ligands (gallamine, W84, LY2119620) on the equilibrium binding of [3H]115, and saturation binding studies with [3H]115 in the presence of the allosteric MR ligand W84 (Schild-like analysis) strongly suggested a competitive mechanism between [3H]115 and the investigated allosteric ligand. Consequently, these data revealed that DIBA-derived heterodimeric ligands such as 115 exhibit a dualsteric binding mode at the M2R.
Moreover, a series of fluorescently labeled, monomeric DIBA-derived ligands was prepared by conjugation of cyanine dyes or a pyrylium dye via different linkers to the dizenzodiazepinone scaffold. Except for one compound, the fluorescent probes exhibited high M2R affinity (Ki < 55 nM). Interestingly, the structure of the fluorophores had less impact on the M2R affinity than the nature of the linker. The fluorescent ligands 135 and 136, bearing red-emitting cyanine dyes attached via linkers with a basic piperazine moiety, exhibited the highest M2R affinity (Ki ca. 1 nM). The M2R preference of the fluorescent ligands was less pronounced compared to the amine-functionalized precursor molecules, i.e. attachment of the lipophilic fluorophores resulted in a decrease in M2R selectivity. Application of 135 and 136 to flow cytometry and high content analysis proved that these new fluorescent probes are suited for such techniques. The fluorescent ligand 136 was identified as a valuable molecular tool for the determination of MR affinities of MR ligands. M2R binding studies with 136 in the presence of allosteric modulators strongly suggested that 136 and structurally related ligands bind simultaneously to both the orthosteric (via the dibenzodiazepinone scaffold) and the ‘common’ allosteric binding site (most likely via the fluorophores) of the M2R, thus exhibiting a dualsteric binding mode, too.
In conclusion, this work afforded new radiolabeled and fluorescently labeled molecular tools for the M2R and suggests dibenzodiazepinone-type MR ligands as an interesting compound class to develop highly selective M2R ligands according to the dualsteric ligand approach.
Translation of the abstract (German)
Die muscarinergen Acetylcholin-Rezeptoren (MR) gehören zur Klasse A der G-Protein gekoppelten Rezeptoren. Im Menschen umfasst die Familie der MR fünf Subtypen (M1R-M5R), die die Wirkung des Neurotransmitters Acetylcholin (Ach) im zentralen und peripheren Nervensystem vermitteln. Zum Beispiel fungiert der M2R, der an G-Proteine des Gi/o¬¬¬-Typs koppelt, als präsynaptischer Autorezeptor. Deshalb ...
Translation of the abstract (German)
Die muscarinergen Acetylcholin-Rezeptoren (MR) gehören zur Klasse A der G-Protein gekoppelten Rezeptoren. Im Menschen umfasst die Familie der MR fünf Subtypen (M1R-M5R), die die Wirkung des Neurotransmitters Acetylcholin (Ach) im zentralen und peripheren Nervensystem vermitteln. Zum Beispiel fungiert der M2R, der an G-Proteine des Gi/o¬¬¬-Typs koppelt, als präsynaptischer Autorezeptor. Deshalb könnte ein selektiver M2R-Antagonismus im ZNS, der zu einer erhöhten ACh-Konzentration im synaptischen Spalt führt, zur Erhöhung der cholinergen Transmission bei Alzheimer-Patienten genutzt werden. MR sind bedeutende Wirkstoff-Targets, jedoch besteht immer noch Bedarf an Subtyp-selektiven MR-Liganden, weil deren Entwicklung aufgrund der hohen Konservierung der orthosterischen Bindungsstelle sehr schwierig ist. Aufgrund der geringeren Konservierung der allosterischen Bindungsstellen stellt die Entwicklung von dualsterisch bindenden Substanzen, d.h. Liganden, die gleichzeitig die orthosterische und eine allosterische Bindungsstelle adressieren, eine aussichtsreiche Strategie zur Entwicklung von hochselektiven MR-Liganden dar.
Ziel dieser Arbeit war die Synthese und pharmakologische Charakterisierung von heterodimeren MR-Liganden vom Dibenzodiazepinon-Typ, die durch Verknüpfung des Dibenzodiazepinon-Pharmakophors „DIBA“ mit verschiedenen MR-Liganden (Agonisten, Antagonisten, ortho- vs. allosterisch) über verschiedene Linker erhalten wurden. Die synthetisierte Serie an Verbindungen umfasste heterodimere Liganden des Typs „DIBA-Xanomelin“, „DIBA-TBPB“, „DIBA-77-LH-28-1“, „DIBA-Propanthelin“ und „DIBA-4-DAMP“ sowie homodimere Liganden des Typs „DIBA-DIBA“. Kompetitionsbindungsstudien mit [3H]NMS an lebenden CHO-hMxR-Zellen (x = 1-5) ergaben hohe M2R-Affinitäten (Ki-Werte: 0.08-5.8 nM) sowie eine M2R-Präferenz für alle von DIBA abgeleiteten dimeren und monomeren Liganden. Diese Daten zeigten, dass die Art des Linkers (kurz vs. lang, basisch vs. nicht-basisch) und der Typ der zweiten pharmakophoren Gruppe nur wenig Einfluss auf die M2R-Bindung hatten. Mono- und homodimere Referenzverbindungen ohne DIBA-Pharmakophor wiesen niedrigere M2R-Affinitäten auf, was darauf schließen lässt, dass die hohe M2R-Affinität der heterodimeren Liganden vom Dibenzodiazepinon-Typ durch den DIBA-Pharmakophor vermittelt wird.
Es wurden zwei Tritium-markierte heterodimere Liganden („DIBA-Xanomelin“- und „DIBA-TBPB“-Typ) hergestellt und durch Sättigungsexperimente und kinetische Bindungsstudien am hM2R charakterisiert. Die Sättigungsexperimente zeigten, dass diese Liganden die orthosterische Bindungsstelle des M2R adressieren. Der „DIBA-TBPB“-artige dimere Radioligand [3H]115 zeigte eine sehr hohe M2R-Affinität (Kd-Wert 0.13 nM). Die Ergebnisse von M2R-Bindungsstudien mit [3H]115 in Gegenwart von allosterischen MR-Liganden (Gallamin, W84, LY2119620), die auch eine „Schild“-Analyse unter Verwendung von W84 umfassten, waren im Einklang mit einem kompetitiven Mechanismus zwischen [3H]115 und den allosterischen Liganden. Daraus konnte geschlussfolgert werden, dass die von DIBA abgeleiteten heterodimeren Liganden, wie z. B. 115, einen dualsterischen Bindungsmodus am M2R aufweisen.
Weiterhin wurden sieben Fluoreszenz-markierte, monomere DIBA-Derivate durch Konjugation des Dibenzodiazepinongerüsts mit einem Cyanin- oder Pyryliumfarbstoff unter Verwendung verschiedener Linker hergestellt. Mit Ausnahme einer Verbindung zeigten diese Fluoreszenzliganden eine hohe M2R-Affinität (Ki < 55 nM). Interessanterweise hatte die Struktur des Fluorophors weniger Einfluss auf die M2R-Affinität als der Typ des Linkers. Die Fluoreszenzliganden 135 und 136, die einen Linker mit einer basischen Piperazin-Einheit und „rot“ emittierende Cyaninfarbstoffe enthalten, wiesen die höchste M2R-Affinität auf (Ki ca. 1 nM). Die M2R-Präferenz aller Fluoreszenzliganden war im Vergleich zu den Amin-funktionalisierten DIBA-Präkursoren weniger ausgeprägt, d.h. die Anknüpfung der hydrophoben Fluorophore führte zu einer Abnahme der M2R-Selektivität. Die Anwendung von 135 und 136 in Durchflusszytometrie- und „High-content Imaging“-basierten Bindungsassays zeigte eine sehr gute Eignung für solche Techniken auf. Die Verwendung von 136 als molekulares Werkzeug für die Bestimmung von MR-Affinitäten von nicht-markierten Liganden wurde demonstriert. M2R-Bindungsstudien mit 136 in Gegenwart von allosterischen Modulatoren legten nahe, dass 136 gleichzeitig in der orthosterischen Bindungsstelle (über das Dibenzodiazepinongerüst) und im allosterischen „Vestibule“ (höchstwahrscheinlich über den Fluorophor) des M2R bindet, was einem dualsterischen Bindungsmodus entspricht.
Zusammenfassend kann festgehalten werden, dass diese Arbeit neue radioaktiv und Fluoreszenz-markierte molekulare Werkzeuge für den M2R hervorgebracht hat und MR-Liganden vom Dibenzodiazepinon-Typ als interessante Verbindungsklasse für die Entwicklung von hochselektiven M2R-Liganden entsprechend dem dualsterischen Ligandkonzept vorschlägt.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 21:27
Owner only: item control page
Download Statistics