| License: Creative Commons Attribution No Derivatives 4.0 (18MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-365238
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.36523
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 20 December 2018 |
| Referee: | PD Dr. Stefanie Sprunck |
| Date of exam: | 21 December 2017 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Pflanzenwissenschaften > Lehrstuhl für Zellbiologie und Pflanzenphysiologie (Prof. Dr. Klaus Grasser) |
| Keywords: | gamete; egg cell; Arabidopsis; fertilization; sperm cell; protein purification; Pichia pastoris; EC1 |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 36523 |
Abstract (English)
Double fertilisation is a highly regulated and complex process that involves four gametes and is unique to flowering plants. Two female gametes, the egg cell and the central cell, fuse with one sperm cell each. This double fertilisation event results in a diploid zygote, which develops into the embryo, and the triploid endosperm, a nutrient-storing and embryo-nourishing tissue. In this thesis, ...
Abstract (English)
Double fertilisation is a highly regulated and complex process that involves four gametes and is unique to flowering plants. Two female gametes, the egg cell and the central cell, fuse with one sperm cell each. This double fertilisation event results in a diploid zygote, which develops into the embryo, and the triploid endosperm, a nutrient-storing and embryo-nourishing tissue.
In this thesis, the focus was primarily placed on the egg-sperm fertilisation mechanism of Arabidopsis thaliana. This particularly included the investigation of the activation, attachment and fusion of the gametes as well as the characterization of sperm-activating EC1 proteins.
In cytological observations on in vivo double fertilisation, the individual phases of egg and sperm cell interactions were characterized using fluorescent marker-lines labelling the gamete plasma membranes. It was shown that the sperm cell membrane is integrated into the egg cell membrane at the sperm-egg fusion site and that the membrane projection, connecting the sperm cell pair with the pollen vegetative cell nucleus, remains outside of the egg and central cell. Furthermore, it could be shown that sperm cell pairs do neither separate from each other nor attach to the female gametes in the ec1-RNAi knockdown mutant lacking egg cell-secreted EC1.
Although the EC1.1-GFP fusion protein can be expressed by all cells of the female gametophyte, the phenotype of undeveloped seeds in the ec1-RNAi knockdown mutant could not be complemented by expression of EC1.1-GFP either in the central cell, the synergid cells or the antipodal cells.
Investigations of the role of EC1 proteins in sperm cell activation revealed that synthetic EC1.1 peptides associate with the sperm cell plasma membrane and trigger both exo- and endocytosis. In particular, endocytosis of membrane associated TET9-GFP is stimulated and the fusogen HAP2-YFP is relocated from the endomembrane system to the plasma membrane. Furthermore, the unpairing of sperm cells seems to be stimulated by the EC1.1 peptide S2. It could be shown that the sperm cell activation, in terms of HAP2-YFP relocalisation to the sperm cell plasma membrane, can be mimicked by a cyclic guanosine monophosphate (cGMP) derivative. This suggests that the second messenger cGMP is involved in the intracellular signal transduction responsible for sperm cell activation. The proposed role for cGMP as a second messenger is furthermore supported by the evidenced expression of two cyclic nucleotide gated channels in A. thaliana sperm cells. Physiological studies on egg cell activation suggest that the secretion of EC1 is not triggered by Ca2+.
The optimization of the purification of EC1.2 fusion proteins, recombinantly expressed in Pichia pastoris cells, will facilitate future studies on EC1 protein structure. Diffusion ordered spectroscopy measurements and size exclusion chromatography suggest that EC1.2 is present as a tetramer at the physiological pH of 7.5. Total correlation spectroscopy indicates that the secondary structure of EC1.2 primary consists of α-helices and turns. Furthermore, it was shown that EC1.2 is able to bind the hydrophobic compound lysoPC, like it has been shown for the related non-specific lipid transfer proteins (nsLTPs). Homology modelling of EC1.2 with the nsLTP DIR1 as a template underpins the structural relationship of EC1 with nsLTPs, as EC1.2 is a globular protein of five α-helices, forming a hydrophobic cavity in the centre that may bind hydrophobic compounds.
Taken together, it could be shown that the EC1 proteins are necessary for sperm cell attachment, sperm cell activation and very likely for the separation of sperm cell pairs in A. thaliana. The results of this thesis suggest that egg cell-secreted EC1 proteins activate sperm cells by interacting with an unknown receptor protein at the sperm cell plasma membrane or by local modulation of the sperm cell plasma membrane lipid composition.
Translation of the abstract (German)
Die doppelte Befruchtung ist einzigartig für Blütenpflanzen und ist ein hoch regulierter und komplexer Prozess, an welchem vier Gameten beteiligt sind. Zwei weibliche Gameten, die Eizelle und die Zentralzelle, fusionieren je mit einer Spermazelle, wobei sowohl eine diploide Zygote entsteht, die sich zu einem Embryo entwickelt, als auch das triploide Endosperm, ein Nährstoff speicherndes und ...
Translation of the abstract (German)
Die doppelte Befruchtung ist einzigartig für Blütenpflanzen und ist ein hoch regulierter und komplexer Prozess, an welchem vier Gameten beteiligt sind. Zwei weibliche Gameten, die Eizelle und die Zentralzelle, fusionieren je mit einer Spermazelle, wobei sowohl eine diploide Zygote entsteht, die sich zu einem Embryo entwickelt, als auch das triploide Endosperm, ein Nährstoff speicherndes und Embryo versorgendes Gewebe.
Der Fokus der vorliegenden Arbeit lag auf den Befruchtungsmechanismen von Ei- und Spermazelle in Arabidopsis thaliana. Das beinhaltete sowohl die Untersuchung der Aktivierung, Adhesion und Fusion der Gameten, als auch die Charakterisierung des Spermazellen aktivierenden EC1-Proteins.
In zytologischen Untersuchungen der doppelten Befruchung im lebenden Organismus wurden die einzelnen Phasen der Eizell- und Spermazellinteraktionen mit Hilfe von transgenen Pflanzenlinien untersucht, welche die Plasmamembranen der Gameten fluoreszent markieren. Es wurde gezeigt, dass die Plasmamembran der Spermazelle an der Fusionsstelle in die Eizelle integiert wird und dass die Membranverlängerung, welche die beiden Spermazellen mit dem Kern der vegetativen Pollenzelle verbindet, außerhalb der Eizelle und Zentralzelle liegen bleibt. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass das Spermazellenpaar in der ec1-RNAi Mutante, in der die Eizellen kein EC1 sekretieren, sich weder trennt noch sich an die weiblichen Gameten anheftet.
Der Phänotyp der ec1-RNAi Mutante zeigt unentwickelte Samen und obwohl das EC1.1-GFP Fusionsprotein von allen Zellen des weiblichen Gametophyten exprimiert werden kann, konnte der Phänotyp weder durch Expression von EC1.1-GFP in der Zentralzelle noch in den Synergiden oder den Antipoden komplementiert werden.
Untersuchungen der Rolle von EC1 Proteinen an der Spermazellaktivierung haben gezeigt, dass synthetische EC1.1 Peptide mit der Plasmamembran der Spermazellen assoziieren und sowohl Exo- als auch Endozytose auslösen. Genauer gesagt wird die Endozytose von Membran lokalisiertem TET9-GFP stimuliert und das Fusogen HAP2-YFP vom Endomembransystem zur Plasmamembran relokalisiert. Außerdem scheint es, als ob das EC1.1 Peptid S2 die Trennung von Spermazellen anregt. Es konnte gezeigt werden, dass die Spermazellaktivierung in Form von HAP2-YFP Relokalisierung von zyklischem Guanosinmonophosphat (cGMP) imitiert werden kann, was darauf hindeutet, dass der sekundäre Botenstoff cGMP in der intrazellullären Signaltransduktion der Spermazellaktivierung beteiligt ist. Die vorgeschlagene Rolle von cGMP als sekundärer Botenstoff wird durch die Tatsache unterstützt, dass die Expression von zwei zyklisch-Nukleotid gesteuerten Ionenkanälen (CNGCs) in den Spermazellen von A. thaliana nachgewiesen werden konnte. Weiterhin deuten physiologische Untersuchungen an Eizellen darauf hin, dass die Sekretion von EC1 nicht durch Ca2+ aktiviert wird.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Aufreinigung von rekombinant in Pichia pastoris exprimierten EC1.2 Fusionsproteinen so weit optimiert, dass weitere Untersuchungen der Proteinstruktur von EC1.2 ermöglicht wurden. Die Ergebnisse aus DOSY-NMR Messungen und Größenausschlusschromatographie weisen darauf hin, dass die EC1 Proteine bei einem physiologischen pH von 7.5 als Tetramer vorliegen. Weiterhin zeigen zweidimensionale TOCSY-NMR Ergebnisse an, dass die Sekundärstruktur von EC1.2 fast ausschießlich aus α-Helices und Schleifen besteht. Es konnte gezeigt werden, dass EC1.2 die hydrophobe Substanz LysoPC binden kann, wie es bereits für die verwandten, nicht-spezifischen Lipidtransportproteine (nsLTPs) gezeigt wurde. Das Homologiemodell von EC1.2 mit dem nsLTP DIR1 untermauert die strukturelle Verwandtschaft zu den nsLTPs, da EC1.2 auch ein kleines, globuläres Protein ist, dass aus fünf α-Helices besteht, welche eine hydrophobe Bindetasche formen, die eine hydrophobe Substanz binden kann.
Zusammengefasst konnte gezeigt werden, dass EC1 Proteine für Spermazelladhäsion, Spermazellaktivierung und sehr wahrscheinlich auch für die Trennung der Spermazellpaare in A. thaliana notwendig sind. Die Ergebnisse dieser Arbeit weisen außerdem darauf hin, dass Eizell-sekretierte EC1 Proteine die Spermazellen aktivieren, indem sie entweder mit einem unbekannten Rezeptorprotein in der Plasmamembran der Spermazellen interagieren oder lokal die Lipidzusammensetzung der Spermazellplasmamembran verändern.
Metadata last modified: 25 Nov 2020 20:36
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