Modifikation der Bupivacain-induzierten Myotoxizität durch selektive Blockade mitochondrialer Ionenkanäle

Item type:	Thesis of the University of Regensburg (PhD)
Open Access Type:	Primary Publication
Date:	24 April 2018
Referee:	PD Dr. Thomas Metterlein
Date of exam:	6 April 2018
Institutions:	Medicine > Lehrstuhl für Anästhesiologie
Keywords:	Myotoxizität, Bupivacain, Apoptose, Mitochondrium. Lokalanästhetika myotoxicity, bupivacaine, mitochondria, apoptosis, local anesthetic
Dewey Decimal Classification:	600 Technology > 610 Medical sciences Medicine
Status:	Published
Refereed:	Yes, this version has been refereed
Created at the University of Regensburg:	Yes
Item ID:	37119

Abstract (German)

Lokalanästhetika, allen voran Bupivacain mit dem höchsten myotoxischen Potential, wirken konzentrationsabhängig toxisch auf Skelettmuskelzellen. Insbesondere Bupivacain ist außerdem in der Lage in Myozyten apoptotische Zellvorgänge zu induzieren. Hier scheinen die Erhöhung des intrazellulären Calcium-Spiegels und die Bildung von „Reaktiv Oxygen Species“ (ROS) eine Rolle zu spielen. Ziel der ...

Abstract (German)

Lokalanästhetika, allen voran Bupivacain mit dem höchsten myotoxischen Potential, wirken konzentrationsabhängig toxisch auf Skelettmuskelzellen. Insbesondere Bupivacain ist außerdem in der Lage in Myozyten apoptotische Zellvorgänge zu induzieren. Hier scheinen die Erhöhung des intrazellulären Calcium-Spiegels und die Bildung von „Reaktiv Oxygen Species“ (ROS) eine Rolle zu spielen. Ziel der Arbeit war es, durch Blockade der „mitochondrialen Permeability Pore“ (mPTP), des „mitochondrial apoptotic channel“ (MAC) und des „mitochondrial Calicum Uniporter“ (MCU) eine Modifizierung der Myotoxizität von Bupivacain zu erreichen, um Rückschlüsse auf die intrazellulären apoptotischen Signalkaskaden ziehen zu können.
Für die Durchführung wurden murine immortalisierte C2C12-Zellen und aus BALB/c AnNcrl Mäuse gewonnene primäre Mausmuskelzellen in vitro mit Bupivacain und den jeweiligen u.g. Substanzen unterschiedlicher Konzentration sowie nach unterschiedlicher Präinkubationszeiten inkubiert. Anschließend wurden die Zellen in eine 24-stündige Erholungsphase überführt. Im Anschluss wurden sie mit Annexin V/FITC (Annexin) und Propidium-Iodid (PI) gefärbt und durchflusszytometrisch untersucht. Beurteilt wurde dabei der Anteil apoptotischer Zellen (PI+/Annexin+, PI−/Annexin+), der Anteil primär nekrotischer Zellen (PI+/Annexin−) und der Anteil vitaler Zellen (PI−/Annexin−).
In den Vorversuchen konnte die Myotoxizität von Bupivacain bestätigt werden. Hierbei zeigte sich eine unterschiedliche Sensibilität von C2C12- und pM-Zellen gegenüber Bupivacain. Die Zugabe von CsA führte bei C2C12-Zellen sogar zu einer signifikant erhöhten Apoptoserate (Bupivacain-Konzentration 1000 ppm und CsA-Konzentration 5 µM). Auch der Anteil vitaler Zellen war hier bei CsA-Konzentrationen von 0,5 µM, 1 µM und 5 µM signifikant erniedrigt. Bei den pM-Zellen konnten keine signifikanten Änderungen gezeigt werden. Für iMAC ließen sich innerhalb der Bupivacain-Gruppen (1000 ppm, 1350 ppm, 1750 ppm) weder bei C2C12-Zellen noch bei pM-Zellen signifikante Veränderungen der Anteile apoptotischer primär nekrotischer oder vitaler Zellen beobachten. Die Blockade des MCU durch Ru360 zeigte bei mittleren Bupivacain-Konzentrationen von 1350 ppm eine Zellmodell-unabhängige tendenzielle Reduktion der Apoptoserate bei Ru360-Konzentrationen von etwa 2,5 µM und 5 µM. Hiermit einhergehend war eine signifikante Reduktion der primär nekrotischen Zellen mit tendenzieller Zunahme der vitalen Zellen.
Zusammenfassend bestärkt die vorliegende Arbeit, dass labortechnisch hergestellte, immortalisierte C2C12-Zellen im Vergleich zu primäre Mausmuskelzellen weniger sensibel auf Lokalanästhetika reagieren. Weiterhin lässt sich die konzentrationsabhängige Toxizität von Bupivacain auf Myozyten in Form einer konzentrationsabhängigen Apoptose zeigen. Es zeigen sich im weiteren Hinweise, dass die Lokalanästhetika-induzierte Myotoxizität zu einem gewissen Grad über eine Erhöhung des intrazellulären Calcium-Levels mitochondrial beeinflusst wird. An vorliegender Arbeit anknüpfend bieten sich weitere Forschungsansätze insbesondere durch Messungen der mitochondrialen Calcium-Austauschprozesse sowie durch die Beobachtung der Effekte von Ionenkanalblockaden auf molekularer Ebene an.

Translation of the abstract (English)

Local anesthetics are known to show concentration dependent toxic effects on skeletal muscle cells. Among the clinically relevant local anesthetics, Bupivacaine is suspected to have the strongest myotoxic potential. The increase of intracellular calcium levels and the formation of reactive oxygen species (ROS) play a crucial role for the myotoxicity of local anesthetics. To better understand the ...

Translation of the abstract (English)

Local anesthetics are known to show concentration dependent toxic effects on skeletal muscle cells. Among the clinically relevant local anesthetics, Bupivacaine is suspected to have the strongest myotoxic potential. The increase of intracellular calcium levels and the formation of reactive oxygen species (ROS) play a crucial role for the myotoxicity of local anesthetics. To better understand the triggers of intracellular apoptotic signaling, the present study investigated whether the inhibition of the mitochondrial permeability pore (mPTP) by ciclosporin A, the mitochondrial apoptotic channel (MAC) by iMAC and the mitochondrial calcium uniporter (MCU) by Ru360 affect the myotoxicity of bupivacaine.
Murine C2C12 cells and primary skeletal muscle cells obtained from BALB/c AnNcrl mice were incubated with different concentrations of bupivacaine and inhibitors of mitochondrial transporters mentioned above. After 24 hours of recovery, muscle cells were stained with FITC-conjugated Annexin V and propidium iodide to determine the numbers of dead cells, live cells and apoptotic cells.
The experiments of the present study clearly confirmed the myotoxic potential of bupivacaine on both cell types, though the primary skeletal muscle cells were shown to be more sensitive. However, neither ciclosporin A nor iMAC nor Ru360 were able to reduce the myotoxicity of bupivacaine significantly in both cell types. Ciclosporin A even decreased the viability of C2C12 cells.
In summary, the present study demonstrated that the inhibition of the channels (mPTP, MAC, MCU) cannot prevent the myotoxic effects of bupivacaine. Further projects might focus on mitochondrial calcium transport and the molecular mechanism of mitochondrial channel inhibitors.

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