Cellular liquid-liquid phase separation (LLPS) results in the formation of dynamic membrane-less granules that play an important role in many biological processes. On a molecular level, the clustering of proteins into a confined space results from an indefinite network of intra- and intermolecular interactions.
Here, we introduce and exploit a novel high-throughput bottom-up approach to study ...
Zusammenfassung (Englisch)
Cellular liquid-liquid phase separation (LLPS) results in the formation of dynamic membrane-less granules that play an important role in many biological processes. On a molecular level, the clustering of proteins into a confined space results from an indefinite network of intra- and intermolecular interactions.
Here, we introduce and exploit a novel high-throughput bottom-up approach to study how the interactions between RNA, the Dcp1:Dcp2 mRNA decapping complex and the scaffolding proteins Edc3 and Pdc1 result in LLPS and the formation of processing bodies (P-bodies). We find that the LLPS boundaries are close to physiological concentrations upon inclusion of multiple proteins and RNA. Within in vitro P-bodies the RNA is protected against endonucleolytic cleavage and the mRNA decapping activity is reduced, which argues for a role of P-bodies in temporary mRNA storage.
Interestingly, the intrinsically disordered region (IDR) in the Edc3 protein emerges as a central hub for interactions with both mRNA and mRNA decapping factors. In addition, the Edc3 IDR plays a role in the formation of irreversible protein aggregates that are potentially detrimental for cellular homeostasis.
Until now, a detailed structural characterization of the intrinsically heterogeneous LLPS process has been challenging. Here, we combine solid- and solution-state NMR spectroscopy to obtain atomic-level insights into the assembly and maturation of in vitro P-bodies. Our results reveal that Edc3 domains exhibit diverse levels of structural organization and dynamics after LLPS. In addition, we find that interactions between the different Edc3 domains and between Edc3 and mRNA in solution are largely preserved in the condensed protein state, allowing P-bodies to rapidly form and dissociate upon small alterations in the cellular environment.
Additionally, we aim at unraveling the role of the conserved helicase Dhh1 in the formation of (in vitro) P-bodies. We found that the LLPS process of Dhh1 contains contributions from the RNA, the IDRs at the N- and C-terminal regions and the folded helicase core domains. Based on mutants of the enzyme, we identified residues in the C-terminal part of the second helicase core domain to be crucial for LLPS of Dhh1. In addition, we found that ATP enhances Dhh1 phase separation, even in the absence of RNA. Our results will allow us to conclude to what degree the above interactions contribute in a constructive manner to LLPS and, by employing NMR spectroscopic methods, which residues are involved in the phase separation process.
In summary, our work sheds light on both the molecular mechanisms that underlie liquid-liquid phase separation and provides clues about how this influences cellular processes.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Die zelluläre Flüssig-Flüssig-Phasentrennung (LLPS) führt zur Bildung dynamischer membranloser Granulate, die bei vielen biologischen Prozessen eine wichtige Rolle spielen. Auf molekularer Ebene resultiert die Anhäufung von Proteinen auf engstem Raum aus einem undefinierten Netzwerk intra- und intermolekularer Wechselwirkungen.
Hier stellen wir einen neuartigen Bottom-up-Ansatz mit hohem ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Die zelluläre Flüssig-Flüssig-Phasentrennung (LLPS) führt zur Bildung dynamischer membranloser Granulate, die bei vielen biologischen Prozessen eine wichtige Rolle spielen. Auf molekularer Ebene resultiert die Anhäufung von Proteinen auf engstem Raum aus einem undefinierten Netzwerk intra- und intermolekularer Wechselwirkungen.
Hier stellen wir einen neuartigen Bottom-up-Ansatz mit hohem Durchsatz vor und nutzen ihn, um zu untersuchen, wie die Wechselwirkungen zwischen RNA, dem Dcp1: Dcp2-mRNA-Decapping-Komplex und den Gerüstproteinen Edc3 und Pdc1 zu LLPS und zur Bildung von Prozessierungskörperchen (P-Bodies) führen. Wir stellen fest, dass die LLPS-Grenze bei Einbeziehung mehrerer Proteine und RNA nahe an der physiologischen Konzentration liegt. Innerhalb von in vitro P-Bodies ist die RNA gegen endonukleolytische Spaltung geschützt und die mRNA-Entkappungsaktivität ist verringert, was für eine Funktion von P-Körpern bei der temporären Lagerung von mRNA spricht.
Interessanterweise stellt sich die intrinsisch ungeordnete Region (IDR) im Edc3 Protein als zentrale Drehscheibe für Wechselwirkungen mit mRNA- und mRNA-Decapping-Faktoren heraus. Darüber hinaus spielt die Edc3 IDR eine Rolle bei der Bildung irreversibler Proteinaggregate, die möglicherweise die zelluläre Homöostase beeinträchtigen.
Bisher war eine detaillierte strukturelle Charakterisierung des intrinsisch heterogenen LLPS-Prozesses eine Herausforderung. Hier kombinieren wir Festkörper- und Lösungs-NMR-Spektroskopie, um atomare Einblicke in den Aufbau und die Reifung von in vitro P-Bodies zu erhalten. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Edc3 Domänen nach LLPS ein unterschiedliches Maß an struktureller Organisation und Dynamik aufweisen. Darüber hinaus stellen wir fest, dass Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen Edc3 Domänen sowie zwischen Edc3 und mRNA in Lösung im kondensierten Proteinzustand weitgehend erhalten bleiben, sodass sich P-Bodies bei kleinen Änderungen in der zellulären Umgebung schnell bilden und wieder auflösen können.
Darüber hinaus wollen wir die Rolle der konservierten Helikase Dhh1 bei der Bildung von (in vitro) P-Bodies aufklären. Wir fanden heraus, dass der LLPS Prozess von Dhh1 Beiträge der RNA, der IDRs an den N- und C-terminalen Regionen und der Domänen des gefalteten Helikase-Kerns enthält. Basierend auf Mutanten des Enzyms identifizierten wir Reste im C-terminalen Teil der zweiten Helikase-Domäne, die für LLPS von Dhh1 entscheidend sind. Zusätzlich fanden wir, dass ATP die Dhh1 Phasentrennung sogar in Abwesenheit von RNA verstärkt. Aus unseren Ergebnissen können wir schließen, inwieweit die oben genannten Wechselwirkungen auf konstruktive Weise zu LLPS beitragen und mit Hilfe von NMR-spektroskopischen Methoden, welche Aminosäuren am Phasentrennungsprozess beteiligt sind.
Zusammenfassend beleuchtet unsere Arbeit sowohl die molekularen Mechanismen, die der Flüssig-Flüssig-Phasentrennung zugrunde liegen, als auch Hinweise darauf, wie diese zelluläre Prozesse beeinflussen.
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