Small changes, unexpected consequences: Molecular insights into substrate-dependent adaptation of KsgA/Dim1-dependent ribosomal RNA modifications in archaea
Classically, life is divided into three phylogenetically interconnected groups of organisms, the archaea, bacteria and eukarya. However, they all share a central and universally conserved molecular component of the cell, a ribonucleoprotein complex known as the ribosome. The assembly of this molecular machine is an orchestration of RNA folding/modification events, hierarchical and cooperative ...
Zusammenfassung (Englisch)
Classically, life is divided into three phylogenetically interconnected groups of organisms, the archaea, bacteria and eukarya. However, they all share a central and universally conserved molecular component of the cell, a ribonucleoprotein complex known as the ribosome. The assembly of this molecular machine is an orchestration of RNA folding/modification events, hierarchical and cooperative incorporation of ribosomal proteins, and the association, dissociation, and interplay of various ribosomal biogenesis factors. Remarkably, this process has become increasingly complex over the course of evolution and has been studied best in bacterial and eukaryotic model organisms. In contrast, the in vivo archaeal ribosome biogenesis pathway(s) lack this detailed insight. Previous in vitro and in silico studies suggested bacterial as well as eukaryotic-like aspects of archaeal ribosome biogenesis. In this work, I have functionally characterized the archaeal homologue of the almost universally conserved ribosomal RNA dimethyltransferase KsgA/Dim1 in vivo.
We could show that this ribosome biogenesis factor is dispensable in the Euryarchaeon Haloferax volcanii and Pyrococcus furiosus, as well as in the Crenarchaeon Sulfolobus acidocaldarius. The loss of this ribosome biogenesis factor in H. volcanii is associated to a decreased cellular fitness and stress adaptation, as well as a differential translational landscape which may correlate with altered translation initiation. Moreover, in this and phylogenetically related organism we observed an unusual heterogeneous/ hypomethylated KsgA/Dim1 dependent methylation pattern. Using phylogenetic-based comparison and genetic analysis, we show that the molecular determinant of this unusual methylation status is based on a single nucleotide exchange within the KsgA/Dim1 targeted rRNA substrate. The structural consequences of this variability could be verified with chemical RNA foot-printing and support a model where KsgA/Dim1-dependent modification disrupts local intramolecular interaction and promotes inter-molecular interaction of 16S/18S rRNA helices. Based on these observations and in vitro reconstitution experiments, this study suggests that release competence of KsgA from the 30S subunit is not dependent on full methylation completion but rather on cooperative local and distant rRNA conformational changes controlled by methylation-induced (intra-molecular) destabilization of the KsgA/Dim1 substrate. Finally, and in addition to this functional analysis, I have implemented and applied chemical RNA foot-printing and 4TU pulse (chase) labelling protocol for H. volcanii and S. acidocaldarius.
Together, this work contributes to a better understanding of archaeal ribosome biogenesis, KsgA/Dim1 biology, and also expands the archaeal tool-box to study RNA metabolism.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Die klassischen Lebewesen sind in drei phylogenetisch verbundene organismische Gruppen aufgeteilt, den Archaeen, Bakterien und Eukaryonten. Was alle drei miteinander verbindet ist eine Zentrale konservierte molekulare Maschine der Zelle, ein ribonuklearer Protein-Komplex, besser bekannt als das Ribosom. Die Assemblierung einer solchen molekularen Maschine ist eine Orchestrierung von RNA ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Die klassischen Lebewesen sind in drei phylogenetisch verbundene organismische Gruppen aufgeteilt, den Archaeen, Bakterien und Eukaryonten. Was alle drei miteinander verbindet ist eine Zentrale konservierte molekulare Maschine der Zelle, ein ribonuklearer Protein-Komplex, besser bekannt als das Ribosom. Die Assemblierung einer solchen molekularen Maschine ist eine Orchestrierung von RNA Faltung/Modifizierung, dem hierarchischen und kooperativen Einbau ribosomaler Proteine, sowie die Assoziierung, Dissoziierung und das Zusammenspiel vieler ribosomaler Biogenesefaktoren. Bemerkenswerterweise ist dieser Prozess im Verlauf der Evolution zunehmend komplexer geworden und am besten in Bakterien und Eukaryonten untersucht. Im Vergleich zu Bakterien und Eukaryonten, fehlen detaillierte in vivo Studien zur archaeellen Ribosomenbiogenese. Frühere, in vitro und in silico Untersuchungen wiesen auf sowohl bakterielle als auch eukaryontische Merkmale der archaeellen Ribosomenbiogenese hin. In dieser Arbeit präsentiere ich eine funktionelle Charakterisierung des archaeellen Homologes, der fast universell konservierten ribosomalen RNA Methyltransferase KsgA/Dim1 in vivo.
Wir konnten zeigen, dass dieser Biogenesefaktor in den Euryarchaeota Haloferax volcanii und Pyrococcus furiosus, sowie im Crenarchaeoten Sulfolobus acidocaldarius nicht essenziell sind. Der Verlust dieses Faktors führt in H. volcanii zu reduzierter zellulärer Fitness und Stresstoleranz sowie einer differenziellen Proteinexpression, die vermutlich mit einer veränderten Translations-Initiation assoziiert ist. Zusätzlich haben wir in diesem und anderen verwandten Organismen einen unerwarteten, heterogenenen bzw. hypomethylierten, durch KsgA/Dim1 induzierten, Methylierungszustand entdeckt. Wir konnten anhand von phylogenetischen Vergleichen und genetischen Analysen den molekularen Ursprung dieses unerwarteten Methylierungszustandes, auf einen einzelnen Basenaustausch im rRNA Substrat von KsgA/Dim1 zurückführen. Die strukturellen Konsequenzen dieser Veränderung konnten wir mithilfe von „chemical RNA foot-printing“ nachweisen. Diese bestärken ein Modell, in dem die KsgA/Dim1 vermittelte RNA Modifizierung lokale intramolekulare Interaktionen destabilisiert und dadurch intermolekulare Interaktionen zwischen Helices der 16S/18S rRNA herstellt. Diese Beobachtungen, sowie in vitro Rekonstitutionsexperimente deuten darauf hin, dass die Dissoziationskompetenz von KsgA/Dim1 von der 30S Untereinheit nicht von der vollen Methylierung abhängig ist, sondern eher von kooperativen, lokalen und entfernten strukturellen Veränderungen, die aus der methylierungsinduzierten Destabilisierung des Substrats resultieren. Zu guter Letzt und zusätzlich zu der funktionellen Analyse, habe ich „chemical RNA foot-printing“ und „4TU-Pulse (chase) labelling“ Protokolle für H. volcanii und S. acidocaldarius etabliert.
Zusammenfassend trägt diese Arbeit zu einem besseren Verständnis der archaeellen Ribosomenbiogenese und der Beschreibung von KsgA/Dim1 bei, sowie eine Erweiterung des Werkzeugkastens zur Analyse des archaeellen RNA Metabolismus.
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