| Lizenz: Creative Commons Namensnennung-KeineBearbeitung 4.0 International (11MB) |
- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-455743
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.45574
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 22 Februar 2022 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Ralf Wagner |
| Tag der Prüfung: | 22 Februar 2021 |
| Institutionen: | Medizin > Lehrstuhl für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene |
| Stichwörter / Keywords: | HIV, Env, Vaccine, Protein |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 45574 |
Zusammenfassung (Englisch)
Evidence from active and passive vaccination trials suggests that both non-neutralizing and neutralizing antibodies (Ab) can confer protection from HIV infection, but the generation of an Envelope-(Env)-based immunogen able to elicit protective humoral responses has not yet been achieved. The major obstacles are high sequence variability, glycan- and structure-mediated shielding of potentially ...
Zusammenfassung (Englisch)
Evidence from active and passive vaccination trials suggests that both non-neutralizing and neutralizing antibodies (Ab) can confer protection from HIV infection, but the generation of an Envelope-(Env)-based immunogen able to elicit protective humoral responses has not yet been achieved. The major obstacles are high sequence variability, glycan- and structure-mediated shielding of potentially beneficial epitopes, as well as structural flexibility displaying distracting immunodominant sites.
In a mammalian cell-based display approach of gp145 (truncated Env lacking the cytoplasmic tail), the mutants L111A and T278H were detected, which lead to improved binding of broadly neutralizing antibodies (bNAbs). L111A showed enhanced binding to the quaternary-structure-dependent antibody PG9. Yet, L111A is not part of the epitope of PG9, but located in Env's interior, indicating that the effect on PG9-binding seems to be caused by an improved conformation or a higher trimer content. Analysis of the soluble L111A gp140 protein showed a decreased monomer content and a more closed conformation, but no negative effect on the affinities measured by ELISA using a panel of bNAbs directed towards the various vulnerable sites. In DSC analysis, the denaturation midpoint was not affected, but a more homogenous unfolding of L111A was observed. The second amino acid exchange, T278H led to improved binding of the CD4-binding-site-specific bNAb VRC01. As the combination of both mutations (LT) facilitated trimer formation while improving the antigenicity, the antibody profile elicited by the LT variant in comparison to the wildtype, was assessed in a pre-clinical animal study in New Zealand White rabbits. In addition to these uncleaved variants, a conformationally closed Env trimer homolog (SOSIP) alone and in combination with LT (SOSIP-LT) was administered as recombinant protein. Additional experiments showed that stabilization of the protein with chemical cross-linking did not affect the trimers, thus cross-linked protein was used for the last protein boost. All four groups developed overall high Ab titers against the autologous antigen (gp140-wt≈LT>SOSIP≈SOSIP-LT). Sera from animals immunized with the uncleaved gp140 trimer showed the least reactivity with the SOSIP-LT homolog, suggesting structural occlusion of immunodominant epitopes in SOSIP-LT. In contrast, the LT variant induced greatest breadth against a panel of eight gp120s of different clades. Moreover, DNA-prime, protein-boost regimens were tested in three further groups. However, there were only little differences on the overall antibody profiles as compared to the protein-only-groups, but animals immunized with this LT developed highest breadth against V1V2 scaffolds following two DNA priming immunizations. Depending on the immunogen, linear epitope mapping showed multiple reactivities toward various parts of Env, with dominating responses toward V3. Whereas all animals developed tier 1 neutralizing Abs, moderate autologous tier 2 neutralizing Abs were only observed in the SOSIP groups.
Overall, our data demonstrate that subtle amino acid substitutions can have a major impact on trimer formation, stability and epitope accessibility, which directly translates into improved titer and breadth of binding Abs as well as neutralizing capacity, depending on the selected immunogen.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Hinweise aus aktiven und passiven Impfstoffstudien deuten darauf hin, dass sowohl nicht-neutralisierende als auch neutralisierende Antikörper (Ab) einen Schutz vor einer HIV-Infektion bieten können. Die Entwicklung eines Envelope-(Env)-basierten Immunogens, dass fähig ist eine schützende humorale Antwort hervorzurufen, wurde jedoch noch nicht erreicht. Die größten Hindernisse sind die hohe ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Hinweise aus aktiven und passiven Impfstoffstudien deuten darauf hin, dass sowohl nicht-neutralisierende als auch neutralisierende Antikörper (Ab) einen Schutz vor einer HIV-Infektion bieten können. Die Entwicklung eines Envelope-(Env)-basierten Immunogens, dass fähig ist eine schützende humorale Antwort hervorzurufen, wurde jedoch noch nicht erreicht. Die größten Hindernisse sind die hohe Sequenzvariabilität, die Glykan- und Strukturvermittelte Abschirmung potenziell nützlicher Epitope sowie die strukturelle Flexibilität, die zu ablenkenden immundominanten Stellen führt.
In einem Säugetierzell-basierten Display-Ansatz von gp145 (verkürztes Env ohne den zytoplasmatischen Schwanz) wurden die Mutanten L111A und T278H entdeckt, die zu einer verbesserten Bindung von breit neutralisierenden Antikörpern (bNAbs) führen. L111A zeigte eine verstärkte Bindung an den quartärstrukturabhängigen Antikörper PG9. Allerdings ist L111A nicht Teil des Epitops von PG9, sondern befindet sich im Inneren des Env, was darauf hindeutet, dass der Effekt auf die PG9-Bindung durch eine verbesserte Konformation oder einen höheren Trimergehalt verursacht sein könnte. Die Analyse des löslichen L111A gp140-Proteins zeigte einen verringerten Monomer-Gehalt und eine geschlossenere Konformation, aber keinen negativen Effekt auf die Affinitäten. Diese wurden mittels ELISA unter Verwendung eines Panels von bNAbs gemessen, die gegen die verschiedenen verwundbaren Stellen gerichtet waren. In der DSC-Analyse war nicht der Denaturierungsmittelpunkt betroffen, sondern es wurde eine homogenere Entfaltung von L111A beobachtet. Der zweite Aminosäureaustausch, T278H, führte zu einer verbesserten Bindung des CD4-Bindungsstellen-spezifischen bNAb VRC01. Da die Kombination beider Mutationen (LT) die Trimerbildung erleichterte und gleichzeitig die Antigenität verbesserte, wurde das Antikörperprofil, das die LT-Variante im Vergleich zum Wildtyp hervorruft, in einer präklinischen Tierstudie an weißen Neuseeland-Kaninchen untersucht. Zusätzlich zu diesen ungespaltenen Varianten wurde ein konformationell geschlossenes Env-Trimer-Homolog (SOSIP) allein und in Kombination mit LT (SOSIP-LT) als rekombinantes Protein verabreicht. Zusätzliche Experimente zeigten, dass die Stabilisierung des Proteins durch chemische Quervernetzung die Trimere nicht beeinträchtigte. Aus diesem Grund wurde für den letzten Protein-Boost quervernetztes Protein verwendet. Alle vier Gruppen entwickelten insgesamt hohe Ab-Titer gegen das autologe Antigen (gp140-wt≈LT>SOSIP≈SOSIP-LT). Seren von Tieren, die mit dem ungespaltenen gp140-Trimer immunisiert wurden, zeigten die geringste Reaktivität mit dem SOSIP-LT-Homolog, was auf eine strukturelle Okklusion der immundominanten Epitope in SOSIP-LT hindeutet. Im Gegensatz dazu induzierte die LT-Variante die größte Breite gegen ein Panel von acht gp120s verschiedener Clades. Darüber hinaus wurden in drei weiteren Gruppen DNA-Prime, Protein-Boost-Schemas getestet. Es zeigten sich jedoch nur geringe Unterschiede in den Gesamtantikörperprofilen im Vergleich zu den Protein-only-Gruppen, jedoch entwickelten die mit LT immunisierten Tiere nach zwei DNA-Priming-Immunisierungen die größte Breite gegen V1V2-Scaffolds. Abhängig vom Immunogen zeigte das lineare Epitop-Mapping multiple Reaktivitäten gegen verschiedene Teile von Env, mit dominierenden Reaktionen gegen V3. Während alle Tiere neutralisierende Abs der Kategorie 1 entwickelten, wurden moderate autologe neutralisierende Abs der Kategorie 2 nur in den SOSIP-Gruppen beobachtet.
Insgesamt zeigen unsere Daten, dass subtile Aminosäuresubstitutionen einen großen Einfluss auf die Bildung von Trimeren, die Stabilität und die Zugänglichkeit von Epitopen haben können, was sich je nach ausgewähltem Immunogen direkt in einem verbesserten Titer und einer größeren Breite der bindenden Abs sowie dem Neutralisationsvermögen niederschlägt.
Metadaten zuletzt geändert: 22 Feb 2022 10:03
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