Einfluss von Bakterien auf die Integrität der epithelialen Barriere im Darm als möglicher Pathomechanismus der spontan bakteriellen Peritonitis bei Leberzirrhose

Item type:	Thesis of the University of Regensburg (PhD)
Open Access Type:	Primary Publication
Date:	6 April 2022
Referee:	Prof. Dr. Martina Müller-Schilling
Date of exam:	23 March 2022
Institutions:	Medicine > Lehrstuhl für Innere Medizin I
Keywords:	K. pneumoniae, p53, tigh junctions, SBP
Dewey Decimal Classification:	600 Technology > 610 Medical sciences Medicine
Status:	Published
Refereed:	Yes, this version has been refereed
Created at the University of Regensburg:	Yes
Item ID:	52001

Abstract (German)

Die spontan bakterielle Peritonitis ist eine schwerwiegende Komplikation der Leberzirrhose. Ihr genauer Pathomechanismus ist bis dato nicht geklärt, gemeinsame Endstrecke ist die bakterielle Translokation, die Durchwanderung von Bakterien aus dem Darmlumen in die mesenterialen Lymphknoten oder in den Aszites bei Patienten mit Leberzirrhose. Wir sprechen dann von einer spontan bakteriellen ...

Abstract (German)

Die spontan bakterielle Peritonitis ist eine schwerwiegende Komplikation der Leberzirrhose. Ihr genauer Pathomechanismus ist bis dato nicht geklärt, gemeinsame Endstrecke ist die bakterielle Translokation, die Durchwanderung von Bakterien aus dem Darmlumen in die mesenterialen Lymphknoten oder in den Aszites bei Patienten mit Leberzirrhose. Wir sprechen dann von einer spontan bakteriellen Peritonitis.
Die vorliegende Arbeit untersucht den Einfluss von K. pneumoniae, einem häufigen Erreger der SBP, auf intestinale Epithelzellen – deren Integrität und p53 Status.
Die Untersuchungen stützten sich auf 2 Zellkulturmodelle: HCT-116 (p53 wildtyp) für die Untersuchung der p53-Familie und Caco-2 Zellen (p53 mutant) für Untersuchung der epithelialen Barrierefunktion. Die Zellen wurden über 3 bis 15 Tage kultiviert und anschließend mit unterschiedlicher MOI von K. pneumoniae für 30 Minuten bis 4 Stunden infiziert. Hitzeinaktivierte Bakterien dienten als Kontrolle. Es wurden Proben für Western Blot und qPCR (Occludin, Claudin 1, Claudin 4, p53), Immunfluoreszenz (Occludin) und Zellzyklusanalysen gewonnen.
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass K. pneumoniae nach 30-minütiger Stimulation von HCT-116 Zellen zu einer transienten Akkumulation von p53 führt. In Übereinstimmung dazu waren weitere Apoptose-assoziierte Proteine (u. a. phospho-RAD17 (S635)) zu Beginn der Infektion erhöht. Die TP53 Genexpression war nach 30 Minuten ebenfalls gesteigert. Darüber hinaus kam es während der Infektion von Caco-2 Zellen mit K. pneumoniae zu einer Reduktion von Claudin 1, Claudin 4 und Occludin. Die Zellzyklusanalyse ergab, dass die Infektion bzw. der Verlust der TJ-Proteine nicht zu einer vermehrten Apoptoserate führte, Zellen allerdings in der G0/G1 Pause akkumulierten.
Es lässt sich schlussfolgern, dass K. pneumoniae durch die Regulation von p53, der Reduktion von TJ-Proteinen und der Einflussnahme auf den Zellzyklus in der Lage ist, die epitheliale Integrität zu beeinflussen und somit die BT möglicherweise begünstigt. Dies dient der Vermehrung und der konsekutiven Durchwanderung der Bakterien. Diese Arbeit identifiziert erstmals p53 als einen wichtigen Regulator der epithelialen Integrität und als einen first line defense Mechanismus bei einer bakteriellen Infektion. Das Gleichgewicht von Bakterien und p53 entscheidet über die bakterielle Vermehrung und Translokation gegenüber der Integrität der Epithelzelle.

Translation of the abstract (English)

Spontaneous bacterial peritonitis is a life-threatening complication of liver cirrhosis. While the exact pathomechanism remains unclear, there is no doubt that bacterial translocation (BT) is one of the key mechanisms. BT is the passage of bacteria from the intestinal lumen to the mesenteric lymph nodes or ascites. This paper investigates the influence of K. pneumoniae, a common pathogen of ...

Translation of the abstract (English)

Spontaneous bacterial peritonitis is a life-threatening complication of liver cirrhosis. While the exact pathomechanism remains unclear, there is no doubt that bacterial translocation (BT) is one of the key mechanisms. BT is the passage of bacteria from the intestinal lumen to the mesenteric lymph nodes or ascites.
This paper investigates the influence of K. pneumoniae, a common pathogen of SBP, on the integrity and the p53 status of intestinal epithelial cells.
Experiments were based on 2 cell culture models: HCT-116 cells (p53 wild type) for analyzing the p53 family and Caco-2 cells (p53 mutant) for analyzing the epithelial barrier function. The cells were cultured for 3 to 15 days and then infected with different MOI of K. pneumoniae for 30 minutes to 4 hours. Heat-inactivated bacteria served as controls. Samples for western blot and qPCR (Occludin, Claudin 1, Claudin 4, p53), immunofluorescence (Occludin) and cell cycle analysis were obtained.
Infection with K. pneumoniae leads to a transient accumulation of p53 after 30 min in HCT-116 cells. Other apoptosis-associated proteins (including phospho-RAD17 (S635)) were increased at the beginning of the infection. TP53 gene expression was also increased after 30 minutes. Furthermore, Claudin 1, Claudin 4 and Occludin were reduced during the infection of Caco-2 cells with K. pneumoniae. The cell cycle analysis showed, that the infection or the loss of the tight junction proteins did not lead to an increased rate of apoptosis, but to an accumulation of cells in the G0/G1 Phase.

K. pneumoniae can impair epithelial integrity by regulating p53, reducing tight junction proteins, interfering with the cell cycle and thus possibly promote BT. This work first identifies p53 as an important regulator of epithelial integrity and as a first line defense mechanism in bacterial infection.

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