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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-528315
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.52831
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Date: | 20 June 2023 |
| Referee: | Prof. Dr. Remco Sprangers |
| Date of exam: | 20 June 2022 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Prof. Dr. Remco Sprangers |
| Keywords: | NMR, protein dynamics, RNA dynamics, fluorine, protein folding |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 52831 |
Abstract (English)
Structural biology has generated profound insights into biomolecular machines. The molecular basis of processes like binding, folding, catalysis and regulation, which underlie the inner working of living organisms would have largely remained unexplored without the thousands of structures that have been solved over the years. But these machines, formed by proteins and nucleic acids, are inherently ...
Abstract (English)
Structural biology has generated profound insights into biomolecular machines. The molecular basis of processes like binding, folding, catalysis and regulation, which underlie the inner working of living organisms would have largely remained unexplored without the thousands of structures that have been solved over the years. But these machines, formed by proteins and nucleic acids, are inherently dynamic, and information about this fourth dimension, the modulation of their structure with time, is often lacking. Nuclear magnetic resonance (NMR) is exquisitely suited to characterize dynamics over a wide timescale, from picoseconds, where amplitudes and correlation times can be extracted, to microsecond, milliseconds and seconds, where in favourable cases information about the kinetics, the thermodynamics and the structure of an excited state can be retrieved. With increasing size of the molecular system under consideration, however, this characterization is progressively challenging for NMR, and the analysis often focuses on 13CH3 spin systems in a perdeuterated background. As an alternative approach, fluorine NMR has grown in popularity. The 19F isotope can be introduced site-specifically, it gives rise to background-free one-dimensional spectra and the technique bypasses the need for perdeuteration. In my disseration, I expanded the existing toolkit of 19F NMR, applied 19F experiments that report on dynamics to high-molecular weight systems and combined their advantages with established methyl group NMR techniques.
Development of 19F relaxation dispersion experiments
To develop 19F relaxation dispersion (RD) experiments, I used a 7.5 kDa cold shock protein from the thermophilic organism Thermotoga maritima as a protein folding/unfolding model system. The global analysis of three RD experiments showed consistent results for the two-state exchange process. Our new rotating frame relaxation pulse sequences allowed to extract the absolute chemical shift of the unfolded state and significantly extended the range of timescales that can be assessed experimentally. Employing a 360 kDa double heptameric complex, I validated the applicability of the experiments on a highly challenging assembly.
Conformational changes in the exoribonuclease Xrn2
The 5'-3' exoribonuclease Xrn2 operates in the nucleus in RNA processing and RNA turn-over pathways. Static structures of its cytoplasmic homologue Xrn1 in the presence of substrates implicate that the enzymes undergo conformational changes to progress through the catalytic cycle. Here, I solved the X-ray structure of Xrn2 from the thermophilic organism Chaetomium thermophilum to 3 Å resolution and combined methyl group and fluorine relaxation dispersion to characterize the exchange in a 100 kDa apo protein core construct in solution. Upon binding of a substrate, the conformational equilibrium is substantially shifted towards the active state. Importantly, the 19F experiments allowed to characterize dynamics in these unstable samples and I could show that the exchange of the enzyme:substrate complex are largely suppressed.
Multi-site exchange in a neomycin-sensing riboswitch
The existence of multiple sparsely populated states complicates the characterization of an exchanging system. Using a synthetic neomycin-binding riboswitch bound to different aminoglycoside ligands, I demonstrated that fluorine NMR can be employed to study exchange topologies with up to four states. To this end, I take advantage of an additional off-resonance technique, 19F chemical exchange saturation transfer. Combined with 19F RD and longitudinal exchange experiments, the results support the notion of a modular impact of aminoglycoside functional groups on the riboswitch dynamics.
Taken together, these results expand and complement the NMR toolbox to study exchanging systems, with an emphasis on high-molecular weight systems and intricate exchange topologies involving more than two states. Furthermore, they elucidate the molecular dynamics in the 5'-3' exoribonuclease Xrn2 and provide a conceptional framework to study dynamics in related systems such as Xrn1.
Translation of the abstract (German)
Die Strukturbiologie hat bemerkenswerte Einblicke in biomolekulare Maschinen hervorgebracht. Die molekulare Basis von Prozessen wie Bindungsvorgängen, Faltung, Katalyse und Regulation, die den inneren Funktionsweisen von lebenden Organismen zugrundeliegen, blieben größtenteils verborgen ohne die tausenden Strukturen, die im Laufe der Jahre gelöst wurden. Diese Maschinen, die von Proteinen und ...
Translation of the abstract (German)
Die Strukturbiologie hat bemerkenswerte Einblicke in biomolekulare Maschinen hervorgebracht. Die molekulare Basis von Prozessen wie Bindungsvorgängen, Faltung, Katalyse und Regulation, die den inneren Funktionsweisen von lebenden Organismen zugrundeliegen, blieben größtenteils verborgen ohne die tausenden Strukturen, die im Laufe der Jahre gelöst wurden. Diese Maschinen, die von Proteinen und Nukleinsäuren gebildet werden, sind allerdings inhärent dynamisch, und oft mangelt es an Information über diese vierte Dimension, die Modulation ihrer Struktur mit der Zeit. Die Kernresonanzspektroskopie (NMR) ist hervorragend dafür geeignet, dynamische Vorgänge über eine Breite von Zeitskalen zu charakterisieren, beginnend bei Dynamiken auf der Pikosekundenskala, für welche Amplituden und Korrelationszeiten extrahiert werden können, bis zu Dynamiken im Mikrosekunden-, Millisekunden- oder Sekundenbereich, für welche in günstigen Fällen Informationen über die Kinetik und die Thermodynamik des Austauschs sowie über die Struktur des angeregten Zustands gewonnen werden können. Mit zunehmender Größe der betrachteten Systeme wird ihre Charakterisierung mittels NMR allerdings auch zunehmend anspruchsvoll und muss in der Regel über 13CH3 Spinsysteme in einem vollständig deuterierten Hintergrund erfolgen. Eine Alternative stellt die Fluor-NMR dar, die an Popularität gewonnen hat. Das 19F Isotop kann ortsspezifisch eingebaut werden, ermöglicht die Messung von eindimensionalen Spektren ohne störende Hintergrundsignale und umgeht die Notwendigkeit der Deuterierung. In meiner Dissertation habe ich den bestehenden Werkzeugkasten der 19F NMR-Dynamikexperimente ausgebaut, diese Experimente auf Systeme mit hohem Molekulargewicht angewendet und ihre Vorteile mit etablierten Methylgruppen-NMR Techniken kombiniert.
Entwicklung von 19F Relaxationsdispersionsexperimenten
Um 19F Relaxationsdispersionsexperimente (RD-Experimente) zu entwickeln habe ich ein 7.5 kDa Kälteschockprotein aus dem thermophilen Organismus Thermotoga maritima als Modellsystem verwendet. Die globale Analyse von drei RD-Experimenten zeigte konsistente Resultate für den Austauschprozess zwischen zwei Zuständen. Unsere neuen Pulsesequenzen zur Messung von Relaxation im rotierenden Bezugssystem erlaubten es, die absolute chemische Verschiebung des ungefalteten Zustandes zu ermitteln und erweiterten die Spannbreite an Austauschzeiten, die experimentell zugänglich ist. Die Anwendbarkeit der Experimente wurde an einem 360 kDa schweren doppelheptameren Komplex validiert.
Konformationsänderungen in der Exoribonuklease Xrn2
Die 5'-3' Exoribonuklease Xrn2 ist im Zellkern in die Prozessierung und den Abbau von RNA involviert. Statische Strukturen des zytoplasmatischen homologen Proteins Xrn1 mit gebundenem Substrat implizieren, dass die Enzyme Konformationsänderungen während des katalytischen Zyklus durchlaufen. In dieser Arbeit habe ich die Kristallstruktur von Xrn2 aus dem thermophilen Organismus Chaetomium thermophilum mit einer Auflösung von 3 Å gelöst und Methylgruppen- und Fluor-RD-Experimente kombiniert um den Austausch in einem 100 kDa Kernkonstrukt von Xrn2 in Lösung zu charakterisieren. Es wird gezeigt, dass die Bindung eines Substrats das Konformationsgleichgewicht erheblich auf die Seite des aktiven Zustandes verschiebt. Die 19F Experimente erlauben es, die Dynamik auch in den instabilen Proben mit gebundenem Substrat zu untersuchen und in der Arbeit wird nachgewiesen, dass der Austausch im Enzym:Substrat-Komplex größtenteils unterdrückt ist.
Austausch mehrere Zustände in einem Neomycin-bindenden Riboswitch
Die Existenz mehrerer niedrigpopulierter Zustände erschwert die Charakterisierung des austauschenden Systems. Mithilfe eines synthetischen Neomycin-bindenden Riboswitches, welcher verschiedene Aminoglykosidliganden bindet, zeige ich, dass Fluor-NMR dazu verwendet werden kann, Austauschtopologien mit bis zu vier Zuständen zu studieren. Hierfür wurde eine zusätzliche Offresonanztechnik verwendet, der 19F Sättigungstransfer. In Kombination mit 19F Relaxationsdispersion und longitudinalen Austauschexperimenten unterstützen die Resultate die Hypothese eines modularen Einflusses verschiedener funktionaler Gruppen in den Aminoglykosidliganden auf die Dynamik im Riboswitch.
Zusammengenommen erweitern und komplementieren die hier vorgestellten Experimente und Resultate den NMR-Werkzeugkasten, um austauschende Systeme zu studieren, insbesondere mit Blick auf hochmolekulare Komplexe und komplizierte Austauschtopologien mit mehr als zwei Zuständen. Darüber hinaus wird die Dynamik in der 5'-3' Exoribonuklease Xrn2 aufgeklärt und der konzeptuelle Rahmen für das Studium verwandter Systeme wie Xrn1 etabliert.
Metadata last modified: 20 Jun 2023 04:31
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