Retinal organoids (ROs) are a 3-dimensional cell culture model system, which mimic the cellular composition and histoarchitecture of native retinal tissue. ROs are differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSC), thereby allowing in vitro investigations into 3D human tissue, comprised of a range of organotypic cell types. In this study, ROs were investigated in the context of two ...
Abstract (English)
Retinal organoids (ROs) are a 3-dimensional cell culture model system, which mimic the cellular composition and histoarchitecture of native retinal tissue. ROs are differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSC), thereby allowing in vitro investigations into 3D human tissue, comprised of a range of organotypic cell types. In this study, ROs were investigated in the context of two distinct queries: RO differentiation and development was improved, and their suitability as a model system for inherited retinal diseases with photoreceptor degeneration, was evaluated.
The first query addresses four distinct projects (i-iv). (i) Three previously published RO differentiation protocols were compared, and the method which produced the highest quantity and best quality of ROs was identified. (ii) Previous reports have suggested that nonstationary culture improves RO differentiation, so the influence of an orbital shaker on RO development was evaluated. Immunocytochemistry and RNA sequencing revealed that nonstationary culture did not significantly impact RO development or maturation. (iii) A technique was developed, which improved RO photoreceptor outer segment retention during processing. (iv) A challenge which was resolved in this study, is the lack of insight into RO development past 11 months. The mRNA expression, protein expression, and histoarchitecture of up to 2-year-old ROs was analyzed, which revealed the preservation of retinal histoarchitecture. In general, photoreceptor marker expression decreased over time, but photoreceptors with pristine morphological development were still present in 2-year-old ROs. Interestingly, Mueller cell marker expression increased over time.
In the second part of this study, two genetically distinct causes for retinitis pigmentosa were investigated. First, ROs were differentiated from patient iPSC with autosomal dominant mutations in the Retinitis Pigmentosa 1 Axonemal Microtubule Associated gene (adRP1), which causes adult-onset RP with degeneration of rod photoreceptors. Investigations into 4-, 5-, and 12-month-old adRP1 ROs showed normal photoreceptor development. In contrast, rod photoreceptor marker expression was significantly reduced in 1.5-year-old adRP1 ROs, indicating that long-term culture of ROs may be suitable to model adult-onset RP. Finally, CRISPR/Cas9-mediated gene editing was used to produce RP1 knockout and isogenic control iPSC, which were then differentiated to ROs. The characterization of RP1 knockout ROs is currently underway. In summary, this project highlights the versatility of ROs as a retinal model.
Translation of the abstract (German)
Retinale Organoide (RO) stellen ein 3-dimensionales Zellkulturmodell dar, welches in ihrer zellulären Zusammensetzung und Histoarchitektur dem nativen retinalen Gewebe nahekommt. ROs werden aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) differenziert und ermöglichen somit in vitro Untersuchungen an menschlichem Gewebe, zusammengesetzt aus einer Vielzahl von organotypischen Zelltypen. In ...
Translation of the abstract (German)
Retinale Organoide (RO) stellen ein 3-dimensionales Zellkulturmodell dar, welches in ihrer zellulären Zusammensetzung und Histoarchitektur dem nativen retinalen Gewebe nahekommt. ROs werden aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) differenziert und ermöglichen somit in vitro Untersuchungen an menschlichem Gewebe, zusammengesetzt aus einer Vielzahl von organotypischen Zelltypen. In dieser Studie wurden ROs im Rahmen von zwei Fragestellungen untersucht: Identifizierung der optimalen Bedingungen zur Ausdifferenzierung der ROs und die Eignung der ROs als Modellsystem für eine erbliche Netzhautdystrophie mit hauptsächlicher Beteiligung der Photorezeptoren.
Die erste Fragestellung adressierte vier abgrenzbare Projekte (i-iv). (i) Drei, von unabhängigen Arbeitsgruppen publizierte, Ausdifferenzierungsprotokolle wurden verglichen und das Protokoll mit der höchsten RO Quantität und Qualität wurde identifiziert. (ii) Vorangegangene Arbeiten haben gezeigt, dass mobile Kulturbedingungen die Ausdifferenzierung und Reifung von ROs verbessern. Aus diesem Grund wurden ROs, welche unter konstanter Bewegung kultiviert wurden, mit stationären ROs verglichen. Analysen mittels Immunzytochemie und RNA-Sequenzierung haben gezeigt, dass die Kulturbedingungen keine signifikanten Unterschiede hervorgerufen haben. (iii) Optimierung der Erntemethode, um die Anzahl der erhaltenen RO Fotorezeptoraußensegmente zu erhöhen, wodurch die Anzahl verdoppelt werden konnte. (iv) Charakterisierung der ROs eines Kultivierungszeitraumes zwischen 6 Monaten und 2 Jahren anhand von mRNAexpression, Proteinexpression und Histoarchitektur. Insgesamt zeigte sich, dass eine längere Kultivierungszeit der ROs mit einer niedrigeren Expression der Fotorezeptormarker einherging. Dennoch konnten auch in den 2-jährigen ROs einzelne, morphologisch gut entwickelte Fotorezeptoren nachgewiesen werden. Interessanterweise wurde mit steigender Kultivierungszeit eine höhere Expression von Müllerzellmarkern festgestellt.
Im Rahmen der zweiten Fragestellung wurden zwei unabhängige genetische Ursachen der Retinitis Pigmentosa Typ 1 untersucht. Zuerst wurden ROs mit autosomal dominanten Mutationen im Retinitis Pigmentosa 1 Axonemal Microtubule Assoziertes Gen (adRP1), welche im Patienten zu Seheinschränkungen im Erwachsenenalter führen, generiert. Nach 4, 5 und 12 Monaten der Kultivierung war die Fotorezeptorentwicklung in adRP1 ROs, im Vergleich zu gesunden Kontrollen, nicht beeinträchtigt. Dahingegen zeigten 18 Monate alte ROs eine signifikant niedrigere Expression von 7 Markergenen, die für den bei der adRP1 betroffenen Fotorezeptortyp, die Stäbchen, spezifisch sind. Aus diesen Ergebnissen lässt sich ableiten, dass lange Kulturzeiten die Eignung von ROs als Modellsystem für erbliche Netzhautdystrophien, mit Beginn der Symptomatik im Erwachsenenalter, verbessern. Zudem wurde das CRISPR/Cas9 System verwendet, um selektiv das RP1 Gen in iPSC stummzuschalten. Ausdifferenzierte ROs werden fortlaufend mit einem vielseitigen Methodenrepertoire untersucht. Zusammenfassend betont dieses Projekt die Vielseitigkeit von ROs als retinales Modellsystem.
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