Synthesis and pharmacological characterization of bivalent and fluorescent ligands to detect receptor dimerization for the D2-H3 heteromer

URN to cite this document:: urn:nbn:de:bvb:355-epub-534495
DOI to cite this document:: 10.5283/epub.53449

Nagl, Martin

License: Creative Commons Attribution 4.0
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(9MB)

Date of publication of this fulltext: 16 Dec 2024 06:03

Details

Item type:	Thesis of the University of Regensburg (PhD)
Open Access Type:	Primary Publication
Date:	16 December 2024
Referee:	Dr. Steffen Pockes
Date of exam:	15 December 2022
Institutions:	Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmaceutical/Medicinal Chemistry I (Prof. Elz)
Keywords:	synthesis, bivalent ligands, fluorescent ligands, receptor dimer
Dewey Decimal Classification:	500 Science > 540 Chemistry & allied sciences
Status:	Published
Refereed:	Yes, this version has been refereed
Created at the University of Regensburg:	Yes
Item ID:	53449

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Abstract (English)

Abstract (English)

The D2-H3 receptor heteromer was discovered for the first time in 2008 when scientists from Barcelona detected heterodimerization between the two receptors in sheep striatal membranes. According to their results the receptor complex highly influences locomotor activation and represents therefore an interesting target for the treatment of Parkinson`s Disease (PD).
The main topic of this thesis was the design, synthesis and pharmacological characterization of bivalent ligands to specifically target this receptor complex. Scaffolds with high affinity for the respective receptor were selected and derivatized to contain either a terminal alkyne moiety or azide function. Linkers were designed to cover lengths from 25 to 75 atoms with special focus on the structures covering distances of 50 atoms. In a final step, pharmacophores and linker were connected in a one-pot CuAAC reaction to yield final bivalent compounds. A total of 26 bivalent ligands was synthesized.
Radioligand binding assays were used for pharmacological characterization of the synthesized compounds. D2R binding was determined by displacement of [3H]N-methylspiperone from homogenates of HEK293T cells stably expressing the D2R. Living HEK293T cells were used to measure H3R affinities in competition binding assays with [3H]UR-PI294. Selected compounds were additionally characterized regarding their selectivity profile within the respective receptor families. Finally, the pharmacological profile with regard to the mode of action of selected compounds was determined in FRET-based cAMP assays.
Another project was the synthesis of fluorescent ligands for D2R like receptors. These compounds should then be used for the establishment of NanoBRET assays for D2R like receptors and as microscopic tool to visualize binding behavior. For this purpose, the potent scaffold spiperone was derivatized with a linker to enable the attachment of fluorescent dyes. Different dyes and linker lengths were used to find out how these two parameters influence affinity and fluorescence properties.
In a final project a bivalent ligand was derivatized to so that fluorescent dyes could be attached to the molecule. These compounds were then checked for their affinities to the D2R and H3R. The best compound was then further characterized in terms of its fluorescent properties as it should then serve as molecular tool to visualize and characterize the formation of the receptor heteromer.
All in all, this PhD thesis describes the successful synthesis of a broad variety of different pharmacological tools to further investigate the processes and consequences regarding the formation of the D2-H3 receptor heterodimer. Future scientists will hopefully benefit from this toolbox to gain new insights into the Het which might lead to new ways for the treatment of PD.

Translation of the abstract (German)

Der D2-H3 Rezeptorheterodimer wurde zum ersten Mal 2008 von einer Gruppe von Wissenschaftlern aus Barcelona beschrieben, als diese eine Dimerisierung der beiden Rezeptoren in Striatummembranen von Schafen nachweisen konnten. Laut ihren Ergebnissen hat der Dimer die einen besonders starken Einfluss auf die lokomotorische Aktivität und stellt daher eine interessante Zielstruktur für die Behandlung von Parkinson dar.
Das Hauptziel dieser Arbeit war das Design, die Synthese und die pharmakologische Charakterisierung von bivalenten Liganden, um den Rezeptorkomplex gezielt zu adressieren. Moleküle mit hoher Affinität für die jeweiligen Rezeptoren wurden ausgewählt und derivatisiert, um entweder eine terminale Alkinstruktur oder eine Azidfunktion zu besitzen. Linker wurden so gestaltet, dass Längen zwischen 25 bis 75 Atome überbrückt werden konnten mit einem besonderen Fokus auf denjenigen Bausteinen, welche eine Distanz von 50 Atomen abdecken. In einem letzten Schritt wurden die Pharmakophore und der Linker in einer Eintopf CuAAC Reaktion verknüpft, um die finalen bivalenten Liganden zu erhalten. Ein Set von insgesamt 26 bivalenten Liganden wurde synthetisiert.
Radioligand-Bindungsassays wurden genutzt, um die synthetisierten Substanzen zu charakterisieren. D2R Bindungsdaten wurden durch Verdrängung von [3H]N-Methylspiperon an Homogenaten von HEK293T Zellen bestimmt. Lebende Zellen wurden genutzt, um die H3R Affinitäten zu messen mit [3H]UR-PI294 als Radioligand. Für ausgewählte Substanzen wurde zusätzlich die Selektivitäten innerhalb der jeweiligen Rezeptorfamilien bestimmt. Abschließend wurde das pharmakologische Profil ausgewählter Substanzen im Hinblick auf ihren Funktionsmodus in FRET-basierten cAMP assays untersucht.
Ein weiteres Projekt der Dissertation war die Synthese von Fluoreszenzliganden für die D2 Rezeptorfamilie. Diese Moleküle sollten dann vor allem zur Etablierung von NanoBRET assays für die D2 Rezeptorfamilie und als Werkzeuge in Mikroskopie-Experimenten dienen. Zu diesem Zweck wurde die hochaffine Substanz Spiperon mit einem Linker derivatisiert, um das Anhängen eines Fluoreszenzfarbstoffs zu ermöglichen. Verschieden Farbstoffe und Linker wurde für die Synthese genutzt, um den Einfluss dieser beiden Parameter auf Affinität und Fluoreszenzeigenschaften genauer zu untersuchen.
In einem letzten Projekt wurde bivalenter Ligand so verändert, dass ein Fluoreszenzfarbstoff problemlos an das Molekül angehängt werden konnte. Die so synthetisierten Liganden wurden anschließend auf ihre Affinität zu den beiden Rezeptoren untersucht. Die beste Substanz wurde weiter in Hinblick ihre Fluoreszenzeigenschaften untersucht und soll nun für die Zukunft als Werkzeug dienen, um den Prozess der Heterodimerisierung zu visualisieren und zu charakterisieren.
So wurde in dieser Arbeit ein breites Spektrum an Molekülen synthetisiert, welche nun in zukünftigen und weiterführenden Projekten zu Einsatz kommen können, um den D2-H3 Rezeptordimer weiter zu untersuchen. Wissenschaftler werden hoffentlich von diesem Werkzeugkasten profitieren, um weitere Einblicke in den D2-H3 Het zu erhalten, was zu neuen Behandlungsmöglichketen für Parkinson führen könnte.

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