Protein-based biopharmaceuticals are produced in living host cells, such as Chinese hamster ovary (CHO) cells. Besides the desired product, other host cell proteins (HCPs) are secreted into the supernatant or released through cell lysis. Since these inevitable process-related impurities possibly have immunogenic effects, may destabilize the product or induce adjuvant activity, they need to be removed largely by appropriate purification methods. The most commonly used method to monitor HCP removal over the entire biopharmaceutical manufacturing and to quantify HCPs in the final monoclonal antibody (mAb) product is the Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA). This method offers the required sensitivity, sample throughput, selectivity, dynamic range, cost efficiency and ease in application. Reliable HCP quantification relies mainly on the ability of the polyclonal anti-HCP ELISA antibodies to detect the heterogeneous HCP population. In this regard, the ratio of HCPs detected by the polyclonal antibodies (pAbs) relative to the complete HCPs is referred to as coverage. ELISA pAbs are produced by immunizing an appropriate host animal with an HCP standard, containing the vast majority of HCPs present in the current manufacturing process. The resulting pAbs need to be tested regarding their coverage by appropriate analytical methods and for their performance in ELISA based HCP quantification.
A major objective in this work was to better understand the influence of the quality of the applied anti-HCP pAbs on their performance in ELISA. The commonly applied method to determine the coverage of HCP-ELISA pAbs, the two-dimensional (2D) western blot (WB), exhibits in general detection gaps. Exact causes for these detection gaps have not yet been clear, but it was suspected that some of these detection gaps originated from inherent technical limitations of the 2D-WB method itself, rather than from a real absence of HCP-specific pAbs. A detailed analysis indicated that the major cause for the detection gaps is the loss of conformational epitopes through protein denaturation during 2D polyacrylamide gel electrophoresis hindering HCP – antibody recognition. Hence, more precise coverage determination can be achieved by using native conditions.
An orthogonal method to 2D-WB, the affinity purification based liquid chromatography-tandem mass spectrometry (AP-MS) method, allows pAb – HCP binding under native conditions. Coupled with the sensitivity of MS, it is therefore a promising method to get a deeper understanding of pAb coverage. However, the AP-MS methods used so far have some limitations, which can lead to false positive hits. An optimized AP-MS based method was developed to circumvent the non-specific binding issues to the matrix by separating the immune-complexed HCPs from the matrix prior to digestion. The method proved to identify covered HCPs unambiguously and therefore can enhance the understanding of antibody binding behavior of single HCPs.
The analytical toolbox developed within this work is very helpful to shed some light on the details of ELISA antibody coverage and facilitates the selection of the most suitable pAbs for reliable HCP quantification by ELISA. It helps to achieve the other main objective of this work, which is to examine the potential for improving coverage by changing the species or even apply a mixture of species. Thus, the influence of the host animal species on coverage was investigated in detail. Comparison of sheep, goat, donkey, rabbit, and chicken derived anti-CHO-HCP pAbs exhibited similar results for all species besides chicken, which clearly fell short in pAb coverage and ELISA performance. The multispecies pAb mixture achieved slightly improved coverage, but did not perform better in the ELISA for HCP quantification of various samples and therefore provided no clear advantage over the single species pAbs.
Overall, 2D-WB to determine coverage should be supplemented by orthogonal methods, which better represent the ELISA conditions for antibody binding and provide additional information. In combination with a performance evaluation of pAbs in ELISAs, this detailed characterization is necessary to make reliable decisions about the suitability of HCP ELISAs, as demonstrated in this work. In turn, the use of appropriate HCP ELISAs helps to increase patient safety by reducing the risk of overlooking individual HCPs or underestimating the total HCP content.

Biopharmazeutika auf Proteinbasis werden in lebenden Wirtszellen, wie z. B. Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (Chinese hamster ovary [CHO]), hergestellt. Neben dem gewünschten Produkt werden auch andere Wirtszellproteine (host cell protein [HCPs]) in den Überstand sezerniert oder durch Zelllyse freigesetzt. Da diese unvermeidbaren prozessbedingten Verunreinigungen möglicherweise immunogene Wirkungen haben, das Produkt destabilisieren oder eine Adjuvant-Aktivität induzieren können, müssen sie durch geeignete Reinigungsverfahren weitestgehend entfernt werden. Die gängigste Methode zur Überwachung der HCP-Entfernung während des gesamten biopharmazeutischen Herstellungsprozesses und zur Quantifizierung der HCPs im monoklonalen Antikörper (monoclonal antibody [mAb]) Endprodukt ist der Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Diese Methode bietet die erforderliche Empfindlichkeit, den Probendurchsatz, die Selektivität, den dynamischen Bereich, die Kosteneffizienz und eine einfache Anwendung. Eine zuverlässige HCP-Quantifizierung hängt hauptsächlich von der Fähigkeit der polyklonalen Anti-HCP-ELISA-Antikörper ab, die heterogene HCP-Population zu erkennen. In diesem Zusammenhang wird das Verhältnis der von den polyklonalen Antikörpern (polyclonal antibody [pAbs]) nachgewiesenen HCPs im Verhältnis zur vollständigen HCP Population als Abdeckung bezeichnet. Die ELISA-pAbs werden durch Immunisierung eines geeigneten Wirtstieres mit dem HCP-Standard hergestellt, welcher die überwiegende Mehrheit der im aktuellen Herstellungsprozess vorhandenen HCPs enthält. Die resultierenden pAbs müssen mit Hilfe geeigneter Analysemethoden auf ihre Abdeckung der HCPs und auf ihre Leistung bei der ELISA-basierten HCP Quantifizierung getestet werden.
Ein Hauptziel dieser Arbeit war es, den Einfluss der Qualität der verwendeten Anti-HCP-pAbs auf deren Leistung im ELISA besser zu verstehen. Die üblicherweise angewandte Methode zur Bestimmung des Abdeckungsgrads von HCP-ELISA pAbs, der zweidimensionale (2D) Western Blot (WB), weist im Allgemeinen Nachweislücken auf. Die genauen Ursachen für diese Nachweislücken waren noch nicht klar, aber es wurde vermutet, dass einige dieser Lücken auf inhärente technische Beschränkungen der 2D-WB-Methode selbst zurückzuführen sind und nicht auf ein tatsächliches Fehlen von HCP-spezifischen pAbs. Eine detaillierte Analyse ergab, dass die Hauptursache für die Detektionslücken der Verlust von Konformationsepitopen durch Proteindenaturierung während der 2D-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ist, durch welchen die HCP - Antikörper Erkennung verhindert wird. Deshalb kann eine genauere Bestimmung des Abdeckungsbereichs durch die Verwendung nativer Bedingungen erreicht werden.
Eine orthogonale Methode zum 2D-WB, die auf Affinitätsreinigung basierende Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (AP-MS) Methode, ermöglicht die pAb-HCP-Bindung unter nativen Bedingungen. In Verbindung mit der Empfindlichkeit der MS ist sie daher eine vielversprechende Methode, um ein tieferes Verständnis der pAb-Abdeckung zu erhalten. Die bisher verwendeten AP-MS-Methoden haben jedoch einige Nachteile, die zu falsch positiven Treffern führen können. Deshalb wurde eine optimierte AP-MS-Methode entwickelt, welche die unspezifischen Bindungsprobleme zur Matrix umgeht, indem die immunkomplexierten HCPs vor dem Verdau von der Matrix getrennt werden. Die Methode hat bewiesen, dass sie abgedeckte HCPs eindeutig identifiziert und daher das Verständnis des Antikörperbindungsverhaltens einzelner HCPs verbessern kann.
Die im Rahmen dieser Arbeit entwickelten analytischen Werkzeuge sind sehr hilfreich, um die Details für ELISA-Antikörperabdeckung zu beleuchten und erleichtern damit die Auswahl der am besten geeigneten pAbs für eine zuverlässige HCP-Quantifizierung mittels ELISA. Sie tragen zur Erreichung des anderen Hauptziels dieser Arbeit bei, nämlich der Untersuchung des Verbesserungspotenzials bei der Abdeckung durch Änderung der Tierspezies oder auch durch Verwendung einer Mischung von verschiedenen Tierspezies. Daher wurde der Einfluss der Tierspezies auf die Abdeckung im Detail untersucht. Der Vergleich der von Schaf, Ziege, Esel, Kaninchen und Huhn stammenden Anti-CHO-HCP pAbs ergab für alle Tierspezies ähnliche Ergebnisse, mit Ausnahme des Huhns, das in Bezug auf die pAb-Abdeckung und der ELISA-Leistung deutlich zurückfiel. Die Multispezies-pAb-Mischung erzielte eine leicht verbesserte Abdeckung, schnitt aber im ELISA für die HCP-Quantifizierung verschiedener Proben nicht besser ab und bot daher keinen eindeutigen Vorteil gegenüber den pAbs von einzelnen Tierspezies.
Insgesamt sollten bei der Bestimmung der Abdeckung der 2D-WBs durch orthogonale Methoden ergänzt werden, welche die ELISA-Bedingungen für die Antikörperbindung besser repräsentieren und zusätzliche Informationen liefern. In Kombination mit einer Leistungsbewertung der pAbs in ELISAs ist diese detaillierte Charakterisierung notwendig, um eine verlässliche Entscheidung über die Eignung von HCP-ELISAs treffen zu können, wie in dieser Arbeit gezeigt wurde. Die Anwendung geeigneter HCP-ELISAs trägt wiederum zur Erhöhung der Patientensicherheit bei, da das Risiko, einzelne HCPs zu übersehen oder den Gesamtgehalt an HCPs zu unterschätzen, sinkt.