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- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-544818
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.54481
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 13 April 2026 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Dr. Silke Wiesner und Prof. Dr. Reinhard Sterner |
| Tag der Prüfung: | 12 April 2023 |
| Institutionen: | Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie |
| Stichwörter / Keywords: | HECT, Ubiquitin, Ubiquitin chains |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 54481 |
Zusammenfassung (Englisch)
Ubiquitination is the covalent attachment of the small 76 amino acid protein ubiquitin to target proteins. Since the discovery of the role of ubiquitination in targeting substrates for proteasomal degradation, a plethora of other roles in the regulation of cellular function have been identified. These roles depend on the way ubiquitin is attached: one or more substrate lysines can be conjugated ...
Zusammenfassung (Englisch)
Ubiquitination is the covalent attachment of the small 76 amino acid protein ubiquitin to target proteins. Since the discovery of the role of ubiquitination in targeting substrates for proteasomal degradation, a plethora of other roles in the regulation of cellular function have been identified. These roles depend on the way ubiquitin is attached: one or more substrate lysines can be conjugated to either mono ubiquitin or multiple ubiquitins, in which ubiquitins are attached to each other forming chains of different linkage and length. Ubiquitination is driven by a cascade of three enzymes, of which the last, the E3 ubiquitin ligase, is responsible for substrate selectivity.
In the HECT-domain (Homologous to the E6-AP Carboxyl Terminus) family of E3 ligases, which are the focus of this thesis, not only substrate selectivity but also linkage specificity is given by the E3. However, the mechanism by which linkage specificity is reached remains unclear. Previous studies showed that a part of the smaller, C-terminal lobe of the HECT domain is responsible for determining linkage specificity, though the molecular mechanism remains elusive. In this work we explored the role of the interface between HECT domain and ubiquitin, also located in the C-terminal lobe. We showed that this interface, and thus the orientation of ubiquitin with respect to the HECT domain, is conserved between HECT domains of different ubiquitin chain linkage specificity, and therefore unlikely to contribute to linkage specificity.
Since HECT domain E3 ligases have been identified as both oncogenes and tumour suppressors, their regulation is of obvious interest. In most members of the HECT domain family, sequences upstream of the catalytic domain, such as C2 or WW domains, are responsible for its inhibition. In this work, we describe a novel mechanism, in which the HECT domain of Huwe1 is inhibited due to a tight interface between its C- and N-terminal lobes, independently of other domains.
Furthermore, while usually HECT domains bind ubiquitin using their ubiquitin-binding surface, we did not detect any such binding for Huwe1. Weakening the inter-lobe interface with point mutations in key residues rendered the ubiquitin-binding surface accessible, allowing us to characterize it. The ubiquitin-binding surface had been postulated to have a positive effect on the activity of the HECT E3 ligases by keeping the ubiquitin chains near the HECT domain between rounds of elongation. Additionally, we showed that in Huwe1, the ubiquitin-binding surface exerts its effect on catalysis independently of chains, possibly by keeping the inter-lobe interface “open”.
Lastly, we sought to investigate factors controlling the chain length. To reduce the complexity of previous systems used in literature, which largely focused on complex kinetical models to fit elongation rates of chains of different lengths from observations of reaction mixtures, we devised a model in which elongation rates of chains of defined length could be observed separately. During set-up optimization, it became apparent that N-terminally epitope tagged ubiquitin, often used in place of wild-type ubiquitin for ease of detection, is unsuitable for this type of ubiquitination studies since it can be ubiquitinated by the HECT domains not only in its lysines but also in its N-terminal amine. This unspecific reaction can be performed by all HECT domains we tested. Therefore, in our experiments we used wild-type ubiquitin. Our results show that elongation rate decreases proportionally to chain length, consistent with a model where individual ubiquitins in a chain can all bind to the HECT domain with equal affinity. In summary, the results presented here provide novel insights into the function and regulation of HECT domain ubiquitin ligases.
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Ubiquitinierung ist die kovalente Bindung des kleinen 76 Aminosäure-Proteins Ubiquitin an Substratproteine. Seit der Entdeckung der Rolle der Ubiquitinierung bei der Markierung von Substraten zum proteasomalen Abbau wurde eine Fülle anderer regulatorischer Rollen identifiziert. Diese Rollen hängen davon ab, wie Ubiquitin gebunden ist: Ein oder mehrere Substrat-Lysine können entweder mit ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Deutsch)
Ubiquitinierung ist die kovalente Bindung des kleinen 76 Aminosäure-Proteins Ubiquitin an Substratproteine. Seit der Entdeckung der Rolle der Ubiquitinierung bei der Markierung von Substraten zum proteasomalen Abbau wurde eine Fülle anderer regulatorischer Rollen identifiziert. Diese Rollen hängen davon ab, wie Ubiquitin gebunden ist: Ein oder mehrere Substrat-Lysine können entweder mit Mono-Ubiquitin oder verschieden verknüpften Ubiquitin-Ketten konjugiert werden. Die Ubiquitinierung wird durch eine Kaskade von drei Enzymen angetrieben, von denen das letzte, die E3-Ubiquitinligase, für die Substratselektivität verantwortlich ist.
In der HECT (Homolog zum E6-AP C-Terminus) Familie der E3-Ligasen, die im Fokus dieser Arbeit stehen, wird nicht nur die Substratselektivität, sondern auch der Verknüpfungstyp der gebildeten Ubiquitin-Ketten durch die E3-Ligase bestimmt. Der Mechanismus, der über die Verknüpfungstyp-spezifität der Ubiquitin-Ketten entscheidet, bleibt jedoch unklar. Frühere Studien zeigten, dass ein Teil der kleineren, C-terminalen Subdomäne der HECT-Domäne für die Bestimmung der Bindungsspezifität verantwortlich ist, wobei der genaue molekulare Mechanismus jedoch unbekannt ist. In dieser Arbeit untersuchten wir die Rolle des Interfaces zwischen HECT-Domäne und Ubiquitin, welches sich ebenfalls in der C-terminalen Subdomäne der HECT-Domäne befindet. Wir haben gezeigt, dass dieses Interface und somit die Orientierung von Ubiquitin in Bezug auf die HECT-Domäne gleich ist zwischen HECT-Domänen mit unterschiedlicher Ubiquitin-Ketten Verknüpfungstyp-Spezifität. Das Interface trägt daher wahrscheinlich nicht zur Spezifität des Verknüpfungstyps bei.
Da Ubiquitin-Ligasen der HECT-Familie sowohl als Onkogene als auch als Tumorsuppressoren fungieren können, ist ihre Regulation von offensichtlichem Interesse. Bei den meisten Mitgliedern der HECT-Domänenfamilie sind Sequenzabschnitte vor der C-terminalen HECT-Domäne, wie C2- oder WW-Domänen, für ihre Hemmung verantwortlich. In dieser Arbeit beschreiben wir einen neuartigen Mechanismus, bei dem die HECT-Domäne von Huwe1 unabhängig von anderen Domänen aufgrund einer engen Schnittstelle zwischen ihren C- und N-terminalen Subdomänen gehemmt wird.
Während HECT-Domänen Ubiquitin normalerweise in einer konservierten nicht-kovalenten Ubiquitin-Bindungsstelle binden, konnten wir für Huwe1 zuerst keine solche Bindung feststellen. Durch die gezielte Schwächung der Schnittstelle zwischen den Subdomänen der HECT-Domäne mit Punktmutationen, wurde die Ubiquitin-bindende Oberfläche zugänglich, sodass wir sie charakterisieren konnten. Während in der Literatur die Bindung der Ubiquitin ketten zwischen den Kettenverlängerungsschritten als Grund für die nicht-kovalenten Ubiquitin-Bindungsstelle angeführt wird, haben wir darüber hinaus gezeigt, dass in Huwe1 die Ubiquitin-bindende Oberfläche ihre Wirkung auf die Katalyse unabhängig von der Kettenbildung ausübt, möglicherweise indem sie das Interface zwischen den beiden Subdomänen „offen“ hält.
Im letzten Teil der Arbeit geht es darum Einblick in die Faktoren, die die Kettenlänge steuern, zu erlangen. Um die Komplexität gegenüber in der Literatur verwendeten Systemen zu reduzieren, welche sich weitgehend auf komplexe kinetische Modelle konzentrierten, welche die Verlängerungsraten von Ketten unterschiedlicher Länge aus Beobachtungen von Reaktionsmischungen bestimmten, entwickelten wir ein Modell, in dem die Verlängerungsraten von Ketten definierter Länge separat beobachtet werden konnten. Beim Aufsetzen des Systems wurde deutlich, dass Ubiquitin mit N-terminalen Epitop-Tags, welches häufig anstelle von Wildtyp-Ubiquitin aufgrund der leichteren Detektion verwendet wird, für diese Art von Ubiquitinierungsstudien ungeeignet ist, da es in den Lysinen im Epitop-Tag sowie im N-terminalen Amin ubiquitiniert werden kann. Diese unspezifische Reaktion wird von allen von uns getesteten HECT-Domänen katalysiert. Um dieses Problem zu vermeiden, verwendeten wir in unseren weiteren Experimenten Wildtyp-Ubiquitin ohne Epitop-Tag. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Elongationsrate proportional zur Kettenlänge abnimmt, was mit einem Modell übereinstimmt, bei dem einzelne Ubiquitine in einer Kette alle mit gleicher Affinität an die HECT-Domäne binden können. Zusammenfassend liefern die hier vorgestellten Ergebnisse neue Einblicke in die Funktion und Regulation von Ubiquitin-Ligasen der HECT-Familie.
Metadaten zuletzt geändert: 13 Apr 2026 07:07
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