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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-582370
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.58237
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 28 March 2025 |
| Referee: | Prof. Dr. Max Keller |
| Date of exam: | 26 March 2024 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmaceutical/Medicinal Chemistry II (Prof. Buschauer) |
| Keywords: | Medizinische Chemie, Synthese, Peptide, Zellbiologische Testung |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 58237 |
Abstract (English)
The family of neuropeptide Y (NPY) receptors (YRs) comprises four subtypes (Y1R, Y2R, Y4R, Y5R). Looking at the Y1R and Y4R, the former is predominantly activated by the endogenous ligand NPY and the Y4R is physiologically activated by pancreatic polypeptide (PP). Both receptors are involved in the regulation of various biological processes, such as pain modulation (Y1R), regulation of energy ...
Abstract (English)
The family of neuropeptide Y (NPY) receptors (YRs) comprises four subtypes (Y1R, Y2R, Y4R, Y5R). Looking at the Y1R and Y4R, the former is predominantly activated by the endogenous ligand NPY and the Y4R is physiologically activated by pancreatic polypeptide (PP). Both receptors are involved in the regulation of various biological processes, such as pain modulation (Y1R), regulation of energy homeostasis (Y1R), cardiovascular effects (Y1R), pancreatic secretion (Y4R), gastrointestinal motility (Y4R) and regulation of food intake (Y1R, Y4R). One subproject of this thesis was the development of amine-functionalized Y1R ligands derived from the reported argininamide-type Y1R antagonist UR-MK299 (2.2), which represent precursors for the synthesis of fluorescently labeled ligands (Chapter 2). In contrast to a reported approach, involving the generation of a second chiral center (Cα of the diphenylacetyl moiety), the formation of diastereomers was avoided. The methine group of the diphenylacetyl motif was replaced by nitrogen and a 4-aminobutoxy substituent was attached to one of the phenyl rings yielding the urea-derivative 2.14. Furthermore, the omittance of one of the phenyl rings yielded the phenylacetic acid derivatives 2.23 and 2.24, which vary in the substitution pattern of the 4-aminobutoxy substituent (meta and para, respectively). Radioligand competition binding studies revealed a drastically decreased Y1R affinity for 2.14 (pKi = 7.1) compared to 2.2 (pKi = 10.1). In the case of 2.23 and 2.24 (pKi = 8.9 and 9.2, respectively), the affinity was also lower, but still high enough to consider 2.23 and 2.24 as precursors for the preparation of labeled ligands.
The major achievements of the present thesis, the development of radio-and fluorescently labeled ligands for the Y4R, are presented in Chapters 3 and 4.
Concerning the determination of Y4R binding affinities in radiochemical assays, hypotonic sodium-free buffers and 125I-labeled derivatives of PP or peptide YY have been predominantly used. A few tritium-labeled Y4R ligands have also been reported, however, when used in buffers containing sodium at a physiological concentration, their Y4R affinities are not ideal (Ki > 5 nM). Based on the cyclic hexapeptide UR-AK86c, showing picomolar Y4R affinity, a new tritium-labeled Y4R radioligand ([3H]3.20) was synthesized (Chapter 3). In sodium-free buffer, [3H]3.20 exhibits a very low Y4R dissociation constant (Kd = 0.032 nM). In sodium-containing buffer (137 mM Na+), the Y4R affinity was lower (Kd = 0.11 nM) (determination not part of this work), but still considerably higher compared to previously reported tritiated Y4R ligands. Therefore, [3H]3.20 represents a useful tool for the determination of Y4R binding affinities under physiological-like conditions.
Aiming for fluorescence-tagged Y4R ligands with high affinity, differently fluorescence labeled (Cy5, Cy3B, Py-1, Py-5) Y4R ligands derived from UR-AK86c, were synthesized, pharmacologically characterized, and applied to fluorescence-based assays (Chapter 4). With pKi values of 9.22-9.71 (radioligand competition binding assay) all fluorescent ligands (4.16- 4.19) showed excellent Y4R affinity. Y4R saturation binding, binding kinetics and competition binding with reference ligands were studied using different fluorescence-based methods: flow cytometry (Cy5, Cy3B and Py-1 label), fluorescence anisotropy (Cy3B label) and NanoBRET (Cy3B label) binding assays. These experiments confirmed the high binding affinity to Y4R (equilibrium pKd: 9.02-9.63) and proved the applicability of the probes for fluorescence-based Y4R competition binding studies. Moreover, the suitability of the Cy3B-labeled ligand 4.16 for imaging techniques such as single receptor molecule tracking, was demonstrated.
In Chapter 5, studies on the photocatalytic effect of a derivative of the rhodamine dye 5- TAMRA (5.2) on the light-induced chemical conversion of tryptophan and tryptophan methyl ester are described (collaboration with Dr. Roger-Jan Kutta, Institute of Physical and theoretical Chemistry, University of Regensburg). Putative photoproducts were analyzed by RP-HPLC, HRMS and NMR. Two things could be unambiguously shown: (1) 5.2 indeed acts as a photocatalyst and (2) singlet oxygen is involved in the photoreaction. In Chapter 6, the synthesis and characterization of a derivative of UR-AK86c, containing a pyrrolidine-type β-amino acid instead of the N-terminal arginine (6.3), is presented (collaboration with Prof. O. Reiser, Institute of Organic Chemistry, University of Regensburg). The pharmacological characterization of peptide 6.3 showed that this amino-functionalized peptide, representing a precursor for the preparation of labeled Y4R ligands, is a Y4R partial agonist showing high Y4R affinity (pKi = 9.5).
Translation of the abstract (German)
Die Familie der Neuropeptid-Y (NPY)-Rezeptoren (YRs) umfasst vier Subtypen (Y1R, Y2R, Y4R, Y5R). Der Y1R, physiologisch primär durch NPY aktiviert, und der Y4R, primär durch das pankreatische Polypeptid (PP) aktiviert, sind beide an der Regulierung verschiedener biologischer Prozesse beteiligt, wie etwa der Schmerzmodulation (Y1R), der Energiehomöostase (Y1R), kardiovaskulären Effekten (Y1R), der ...
Translation of the abstract (German)
Die Familie der Neuropeptid-Y (NPY)-Rezeptoren (YRs) umfasst vier Subtypen (Y1R, Y2R, Y4R, Y5R). Der Y1R, physiologisch primär durch NPY aktiviert, und der Y4R, primär durch das pankreatische Polypeptid (PP) aktiviert, sind beide an der Regulierung verschiedener biologischer Prozesse beteiligt, wie etwa der Schmerzmodulation (Y1R), der Energiehomöostase (Y1R), kardiovaskulären Effekten (Y1R), der pankreatischen Sekretion (Y4R), der gastrointestinalen Motilität (Y4R) und der Regulierung der Nahrungsaufnahme (Y1R, Y4R). Ein Teilprojekt dieser Arbeit war die Entwicklung von Amino-funktionalisierten Y1R-Liganden, die vom beschriebenen Argininamid-Typ-Y1R-Antagonisten UR-MK299 (2.2) abgeleitet sind und Vorläufer für die Synthese fluoreszenzmarkierter Liganden darstellen (Kapitel 2). Im Gegensatz zu einem beschriebenen Ansatz, der das Auftreten eines zweiten Chiralitätszentrums (Cα der Diphenylacetyleinheit) beinhaltete, wurde die Bildung von Diastereomeren vermieden. Die Methingruppe des Diphenylacetylmotivs wurde durch Stickstoff ersetzt und ein 4-Aminobutoxysubstituent an einen der Phenylringe gebunden (Harnstoffderivat 2.14). Darüber hinaus ergab das Weglassen eines der Phenylringe die Phenylessigsäurederivate 2.23 und 2.24, die sich im Substitutionsmuster des 4-Aminobutoxy-Substituenten (meta bzw. para) unterscheiden. Rezeptorbindungsstudien ergaben eine drastisch verringerte Y1R-Affinität für 2.14 (pKi = 7,1) im Vergleich zu 2.2 (pKi = 10,1). 2.23 und 2.24 (pKi = 8,9 bzw. 9,2) zeigten ebenfalls eine verringerte Affinität, aber immer noch hoch genug, um 2.23 und 2.24 als Vorläufer für die Herstellung markierter Liganden in Betracht zu ziehen.
Die wichtigsten Errungenschaften der vorliegenden Arbeit, die Entwicklung radio- und fluoreszenzmarkierter Y4R-Liganden, werden in den Kapiteln 3 und 4 vorgestellt.
Zur Bestimmung der Y4R-Affinitäten in radiochemischen Assays wurden bisher überwiegend hypotone natriumfreie Puffer und 125I-markierte Derivate von PP oder Peptid YY verwendet. Des Weiteren wurden wenige Tritium-markierte Y4R-Liganden beschrieben. Bei Anwendung in Puffern, die Natrium in physiologischer Konzentration enthalten, sind die Y4R-Affinitäten der Tritium-markierten Liganden jedoch suboptimal (Ki > 5 nM). Basierend auf dem zyklischen Hexapeptid UR-AK86c, das eine pikomolare Y4R-Affinität zeigt, wurde ein neuer Tritium-markierter Y4R-Radioligand ([3H]3.20) synthetisiert (Kapitel 3). In natriumfreiem Puffer weist [3H]3.20 einen sehr niedrigen Kd-Wert von 0,032 nM am Y4R auf. In natriumhaltigem Puffer (137 mM Na+) war die Y4R-Affinität geringer (Kd = 0,11 nM) (Bestimmung nicht Teil dieser Arbeit), aber immer noch erheblich höher im Vergleich zu den zuvor beschriebenen tritiierten Y4R-Liganden. Daher stellt [3H]3.20 ein nützliches molekulares Werkzeug zur Bestimmung von Y4R-Affinitäten in Puffern mit physiologischer Natriumkonzentration dar.
Mit dem Ziel, fluoreszenzmarkierte Y4R-Liganden mit hoher Affinität zu erhalten, wurden unterschiedlich fluoreszenzmarkierte (Cy5, Cy3B, Py-1, Py-5) Y4R-Liganden, abgeleitet von UR-AK86c, synthetisiert, pharmakologisch charakterisiert und in fluoreszenzbasierten Assays angewendet (Kapitel 4). Mit pKi-Werten von 9,22-9,71 (Radioligand-Kompetitionsbindungsassay) zeigten alle Fluoreszenzliganden (4.16-4.19) eine ausgezeichnete Y4R-Affinität. Y4R-Sättigungsbindung, Bindungskinetik und Kompetitionsbindung mit Referenzliganden wurden mit verschiedenen fluoreszenzbasierten Methoden untersucht: Durchflusszytometrie (Cy5-, Cy3B- und Py-1-Markierung), Fluoreszenzanisotropie (Cy3B) und NanoBRET-Bindungsassays (Cy3B). Diese Experimente bestätigten die hohe Y4R-Affinität (pKd: 9,02-9,63) und bewiesen die Anwendbarkeit der markierten Liganden für fluoreszenzbasierte Y4R-Kompetitionsbindungsstudien. Darüber hinaus wurde die Eignung des Cy3B-markierten Liganden 4.16 für Imaging-Experimente wie „Single molecule tracking“ demonstriert.
In Kapitel 5 werden Studien zur photokatalytischen Wirkung eines Derivats des Rhodaminfarbstoffs 5-TAMRA (5.2) auf die lichtinduzierte chemische Umwandlung von Tryptophan und dessen Methylester beschrieben (Kooperation mit Dr. Roger-Jan Kutta, Institut für Physikalische und Theoretische Chemie, Universität Regensburg). Mutmaßliche Photoprodukte wurden mittels RP-HPLC, HRMS und NMR analysiert. Es konnte folgendes eindeutig gezeigt werden: 1. 5.2 wirkt tatsächlich als Photokatalysator und 2. Singulettsauerstoff ist an der Photoreaktion beteiligt.
In Kapitel 6 wird die Synthese und Charakterisierung eines Derivats von UR-AK86c vorgestellt (6.3), das anstelle des N-terminalen Arginins eine β-Aminosäure vom Pyrrolidin-Typ enthält (Kooperation mit Prof. O. Reiser, Institut für Organische Chemie, Universität Regensburg). Die pharmakologische Charakterisierung von Peptid 6.3 zeigte, dass dieses Amino -funktionalisierte Peptid, das einen Vorläufer für die Herstellung markierter Y4R-Liganden darstellt, ein Y4R-Partialagonist mit hoher Y4R-Affinität ist (pKi = 9,5).
Metadata last modified: 28 Mar 2025 09:14
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