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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-597177
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.59717
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 16 December 2024 |
| Referee: | Assoc. Prof. Hans-Heiner Gorris |
| Date of exam: | 29 November 2024 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik > Bioanalytik und Biosensorik (Prof. Joachim Wegener) |
| Keywords: | Photon-upconversion nanoparticles; Digital readout; Nanoparticle surface modification; Highly-sensitive (immuno-)assays |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 500 Natural sciences & mathematics 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 59717 |
Abstract (English)
The main focus of this thesis lies on the use of photon upconversion nanoparticles (UCNPs) as labels in bioaffinity assays. UCNPs are inorganic nanoparticles with unique optical properties compared to other optical labels such as quantum dots or fluorophores. Under near infrared (NIR) excitation UCNPs absorb two or more photons and emit a photon of shorter wavelength (higher energy), so called ...
Abstract (English)
The main focus of this thesis lies on the use of photon upconversion nanoparticles (UCNPs) as labels in bioaffinity assays. UCNPs are inorganic nanoparticles with unique optical properties compared to other optical labels such as quantum dots or fluorophores. Under near infrared (NIR) excitation UCNPs absorb two or more photons and emit a photon of shorter wavelength (higher energy), so called anti-Stokes emission. The excitation under NIR light has several advantages, such as the drastic reduction in background signal due to autofluorescence and reduced light scattering. Another advantage of UCNPs is their high photostability, constant emission and low toxicity which makes them ideal labels for a wide variety of bioanalytical applications. The lack of background signal is particularly beneficial for digital readout methods.
The first part of this thesis describes the fundamentals of bio-assays with particular focus on different assay setups and readout methods explained. This is followed by a discussion of various biorecognition elements and introduction of the most important label types. The introduction part concludes with an overview of UCNPs, detailing the upconversion mechanism and emphasizing the surface modification of UCNPs. The second part of this thesis contains three original publications made during the PhD time.
The first research article focuses on the effect of surface chemistry and particle size on the assay sensitivity. Cardiac troponin I was selected as highly relevant biomarker for the early detection of myocardial infarction using a sandwich ULISA format with two capture and two detection antibodies. Two different UCNP surface modifications were tested using either PEG or PAA. Coating the UCNPs with alkyne-PEG-neridronate was followed by a modification with click reactive streptavidin-azide and the use of biotinylated detection antibodies in the assay. The PAA-coated UCNPs, on the other hand, were used and further modified with detection antibodies using EDC/NHS chemistry while biotinylated capture antibodies were immobilized on streptavidin coated microtiterplate. Furthermore, for PAA modified UCNPs the influence of nanoparticle size on assay performance was evaluated. For all tested UCNP surface modifications and sizes, the assay readout was performed in the analogue (using a microtiterplate reader) and the digital (with the upconversion microscope) mode. The particle size and surface modification of the used labels had much larger influence than the readout method. With the optimal surface modification and particle size, PAA coated UCNPs (48 nm in size) an LOD of 10 pg/mL of cTnI in human plasma, for both readout methods was achieved.
The second article concentrates on the analogue and digital detection of SARS-CoV-2 nucleocapsid protein (N protein) using an upconversion linked immunosorbent assay. The N protein was selected due to its abundance and low rate of mutation, making it the optimal target antigen. In this work, we employed UCNPs modified with SA-PEG in combination with biotinylated detection antibodies in a conventional 2+2 sandwich assay format. We investigated the influence of the readout method and antibody selection on the assay sensitivity. The selection of capture and detection antibodies had a significant influence on assay performance, improving the assay sensitivity nearly 100-fold, and with the optimal antibody combination, an LOD of 1.4 pg/mL for the detection of the recombinant N protein was achieved. By changing from the analogue to the digital readout method no changes in assay sensitivity were observed for the detection of the recombinant N protein while the digital redout improved the detection of SARS-CoV-2 in virus lysate by a factor of 10 (0.8 TCID₅₀/mL analogue and 0.08 TCID₅₀/mL digital). This observation supports our previous hypothesis that a high antibody affinity is needed before the digital readout can further improve the assay sensitivity.
The third research article focuses on the development of a highly sensitive assay for pathogen detection using bacteriophage M13 as a model analyte. To combine the simplicity of nucleic acid hybridization assays with the sensitivity amplification-based assays, we developed an upconversion branched DNA (bDNA) hybridization assay. The signal amplification stems from a series of oligonucleotide probes hybridizing in a branched structure with several hybridization sites for biotinylated amplification probes binding up to twelve SA-PEG modified UCNPs to a single target sequence. Different generations of bDNA assays and configurations were tested to achieve the best assay sensitivity. A setup similar to the second-generation assay, using branched amplification probes paired with label and capture extenders to minimize steric hindrance achieved a LOD of 5.9 × 10⁴ CFU/mL. The assay susceptibility towards mutations of the target genome was reduced by selecting a wide genomic range for the capture probes and extenders. Furthermore, compared to assays based on target amplification, such as PCR, the bDNA assay enables quantitative detection and is more robust regarding complex sample matrices. By exchanging the capture probes the presented upconversion-linked bDNA assay can be easily adapted to other target DNAs.
Overall, the work conducted in this thesis showed that UCNPs are highly versatile labels for sensitive bio-assays. The wide range of target analyte sizes, from nucleic acids to viral particles, demonstrated the applicability of UNCPs in different assay setups. Furthermore, the digital readout methods proved its potential to increase the assay sensitivity drastically, although it was also seen to be limited by the antibody affinity and particle brightness. Further improvements could be achieved with smaller and brighter particles and a better understanding of their behaviour in different assay formats. Nevertheless, further research is essential to fully harness the exceptional properties of UCNPs for real-world applications and improved diagnostics.
Translation of the abstract (German)
Der Fokus dieser Arbeit liegt auf der Verwendung von Photonen-Aufkonvertierenden Nanopartikeln (UCNPs) als Marker in Bioaffinitätsassays. UCNPs sind anorganische Nanopartikel mit einzigartigen optischen Eigenschaften im Vergleich zu anderen optischen Markern wie Quantenpunkten oder Fluorophoren. Unter Nahinfrarot-Anregung (NIR) absorbieren UCNPs zwei oder mehr Photonen und emittieren ein Photon ...
Translation of the abstract (German)
Der Fokus dieser Arbeit liegt auf der Verwendung von Photonen-Aufkonvertierenden Nanopartikeln (UCNPs) als Marker in Bioaffinitätsassays. UCNPs sind anorganische Nanopartikel mit einzigartigen optischen Eigenschaften im Vergleich zu anderen optischen Markern wie Quantenpunkten oder Fluorophoren. Unter Nahinfrarot-Anregung (NIR) absorbieren UCNPs zwei oder mehr Photonen und emittieren ein Photon kürzerer Wellenlänge (höhere Energie), sogenannte Anti-Stokes-Emission. Die Anregung durch NIR-Licht bietet mehrere Vorteile, wie die drastische Reduzierung des Hintergrundsignals aufgrund von Autofluoreszenz und verringerter Lichtstreuung. Ein weiterer Vorteil von UCNPs ist ihre hohe Photostabilität, konstante Emission und geringe Toxizität, was sie zu idealen Markern für eine Vielzahl bioanalytischer Anwendungen macht. Insbesondere das Fehlen von Hintergrundsignalen macht sie zu einem idealen Marker für digitale Auslesemethoden.
Im ersten Teil dieser Arbeit werden die Grundlagen und allgemeinen Prinzipien von Bioanalytischen-Assays erklärt. Zunächst werden verschiedene Assay-Aufbauten zusammen mit zwei unterschiedlichen Auslesemethoden beschrieben. Darauf folgt eine Diskussion über eine Vielzahl von Bioerkennungselementen, und die wichtigsten Markertypen werden vorgestellt. Der Einleitungsteil schließt mit einem Überblick über UCNPs und dem Aufkonvertierungs-Mechanismus ab, wobei ein besonderer Fokus auf die Oberflächenmodifikation von UCNPs gelegt wird. Der zweite Teil dieser Arbeit umfasst drei Originalpublikationen, die während der Promotionszeit entstanden sind.
Der erste Forschungsartikel konzentriert sich auf den Effekt der Oberflächenmodifikation und der Partikelgröße auf die Assay Sensitivität. Kardiales Troponin I wurde als hochrelevanter Biomarker für die Früherkennung von Myokardinfarkten ausgewählt. Hierbei wurde das Sandwhich-ULISA-Format mit zwei Fänger- und zwei Detektionsantikörpern verwendet. Zwei verschiedene UCNP-Oberflächenmodifikationen wurden getestet. Die erste bestand darin, die UCNPs mit Alkin-PEG-Neridronat zu beschichten und anschließend mit klick-reaktiven Streptavidin-Azid zu modifizieren. Hierbei wurden biotinylierte Detektionsantikörper verwendet. Bei der zweiten Oberflächenmodifikation wurden PAA-beschichtete UCNPs verwendet und mit Detektionsantikörpern unter Verwendung von EDC/NHS-Chemie modifiziert. Bei Verwendung dieser Antikörper-PAA-UCNP Konjugaten wurden die Fängerantikörper biotinyliert und auf einer streptavidin-beschichteten Mikrotiterplatte immobilisiert. Zudem wurden bei PAA-modifizierten UCNPs der Einfluss der Partikelgröße auf die Assay-Leistung untersucht. Für alle getesteten UCNP-Oberflächenmodifikationen und -Größen wurde die Assayauslesung sowohl im analogen (über Mikrotiterplattenleser) als auch im digitalen (über Aufkonversions-Mikroskop) Modus durchgeführt. Die Partikelgröße und Oberflächenmodifikation der verwendeten Marker hatten einen weitaus größeren Einfluss auf die Assay Sensitivität als die Auslesemethode. Mit der optimalen Oberflächenmodifikation und Partikelgröße wurde eine Nachweisgrenze (LOD) von 10 pg/mL cTnI im menschlichen Plasma für beide Auslesemethoden erreicht.
Der zweite Artikel konzentriert sich auf den analogen und digitalen Nachweis des SARS-CoV-2-Nukleokapsidproteins (N-Protein) unter Verwendung eines Aufkonversions-gekoppelten Immunosorbens-Assays. Das N-Protein wurde aufgrund seiner Häufigkeit und der niedrigen Mutationsrate als optimales Zielantigen ausgewählt. In dieser Arbeit wurden UCNPs modifiziert mit SA-PEG in Kombination mit biotinylierten Detektionsantikörpern im herkömmlichen 2+2-Sandwich-Assay-Format eingesetzt. Wir untersuchten den Einfluss der Auslesemethode und der Antikörperauswahl auf die Assay Sensitivität. Die richtige Auswahl der Fänger- und Detektionsantikörper zeigte einen signifikanten Einfluss auf die Assayleistung und verbesserte die Sensitivität des Assays um fast das 100-fache. Mit der optimalen Antikörperkombination wurde eine Nachweisgrenze von 1,4 pg/mL für den Nachweis des rekombinanten N-Proteins erreicht. Durch den Wechsel von der analogen zur digitalen Auslesemethode wurden keine Änderungen der Assaysensitivität für den Nachweis des rekombinanten N-Proteins beobachtet, während die digitale Auslesung die Detektion von SARS-CoV-2 im Virenlysat um das Zehnfache verbesserte (0,8 TCID₅₀/mL analog und 0,08 TCID₅₀/mL digital).
Diese Beobachtung stützt unsere vorherige Hypothese, dass eine hohe Antikörperaffinität erforderlich ist, bevor die digitale Auslesung die Assay Sensitivität weiter verbessern kann.
Der dritte Forschungsartikel konzentriert sich auf die Entwicklung eines hochempfindlichen Assays zum Pathogennachweis unter Verwendung von Bakteriophage M13 als Modellanalyten. Um die Einfachheit von Nukleinsäure-Hybridisierungsassays mit der Sensitivität von amplifikationsbasierten Assays zu kombinieren, entwickelten wir einen Aufkonversions-basierten, verzweigten DNA (bDNA)-Hybridisierungsassay. Die Signalverstärkung resultiert aus einer Reihe von Oligonukleotidsonden, die sich in einer verzweigten Struktur mit mehreren Hybridisierungsstellen für biotinylierte Amplifikationssonden hybridisieren. Diese verzweigten biotinylierten Amplifikationssonden können bis zu 12 SA-PEG-modifizierte UCNPs an eine einzelne Zielsequenz binden. Verschiedene Generationen von bDNA-Assays und Konfigurationen wurden getestet, um die beste Assay Sensitivität zu erreichen. Ein Setup, das dem Assay der zweiten Generation ähnelt, bei dem verzweigte Amplifikationssonden mit Label- und Fängerextendern gepaart wurden, um sterische Hinderungen zu minimieren, erreichte eine Nachweisgrenze von 5,9 × 10⁴ CFU/mL. Die Anfälligkeit der Assays gegenüber Mutationen des Zielgenoms wurde durch die Auswahl eines breiten genomischen Bereichs für die Fängersonden und Extender reduziert. Im Vergleich zu Assays basierend auf Amplifikation der Ziel-DNA, wie z. B. PCR, ermöglicht der bDNA-Assay eine quantitative Detektion und ist robuster gegenüber komplexen Probenmatrizes. Durch den Austausch der Fängersonden kann der präsentierte Upconversion-verknüpfte bDNA-Assay leicht an andere Ziel-DNAs angepasst werden.
Insgesamt zeigt die in dieser Arbeit durchgeführte Forschung, dass UCNPs höchst vielseitige Marker für empfindliche Bio-Assays sind. Die breite Vielfalt an Zielanalyten, die von Nukleinsäuren bis hin zu Viruspartikeln reicht, demonstriert die Anwendbarkeit von UNCPs in verschiedenen Assay-Aufbauten. Darüber hinaus hat sich die digitale Auslesung als potenziell äußerst wirksam zur Erhöhung der Assay Sensitivität, jedoch auch als stark eingeschränkt durch die Antikörperaffinität und Partikelhelligkeit erwiesen. Weitere Verbesserungen könnten möglicherweise durch kleinere und hellere Partikel sowie ein besseres Verständnis ihres Verhaltens in verschiedenen Assay-Formaten erreicht werden. Nichtsdestotrotz ist weitere Forschung entscheidend, um das volle Potenzial der außergewöhnlichen Eigenschaften von UCNPs für reale Anwendungen und bessere Diagnostik zu erschließen.
Metadata last modified: 16 Dec 2024 09:07
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