| Lizenz: Veröffentlichungsvertrag für Publikationen ohne Print on Demand (1MB) |
- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-5864
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.10402
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 5 November 2006 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Stephan (Prof. Dr.) Schneuwly |
| Tag der Prüfung: | 26 September 2005 |
| Institutionen: | Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Zoologie > Entwicklungsbiologie (Prof. Dr. Stephan Schneuwly) |
| Stichwörter / Keywords: | Epstein-Barr-Virus , Transplantation , Immunsuppression , Polymerase-Kettenreaktion , Messenger-RNS , Nierentransplantation , Periphere Stammzellentransplantation , Replikation , real-time PCR , TaqMan , RT-PCR , virale Expressionsmuster , cytotoxische T-Zellen , viral expression pattern , cytotoxic T-lymphocyte , immunosuppression |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 10402 |
Zusammenfassung (Deutsch)
Mehr als 95% der erwachsenen Bevölkerung sind mit dem Epstein-Barr Virus infiziert. Nach der Primärinfektion persistiert das Virus lebenslang in ruhenden B-Zellen. Bei gesunden Trägern kommt es immer wieder zur Freisetzung des Virus im Oropharynx. Eine effektive immunologische Kontrolle verhindert jedoch eine unkontrollierte Replikation des Virus und die Proliferation latent infizierter ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Mehr als 95% der erwachsenen Bevölkerung sind mit dem Epstein-Barr Virus infiziert. Nach der Primärinfektion persistiert das Virus lebenslang in ruhenden B-Zellen. Bei gesunden Trägern kommt es immer wieder zur Freisetzung des Virus im Oropharynx. Eine effektive immunologische Kontrolle verhindert jedoch eine unkontrollierte Replikation des Virus und die Proliferation latent infizierter B-Zellen.
Unter Immunsuppression (z.B. nach Transplantationen) kann dieses immunologische Gleichgewicht gestört sein. Es kommt zu viralen Reaktivierungen und in einigen Prozent der Patienten zu EBV-assoziierten Lymphoproliferationen (PTLD; post-transplant lymphoproliferative disease).
In dieser Arbeit wurden sensitive real-time PCR-Systeme zur Quantifizierung viraler mRNAs etabliert um virale Expressionsmuster in vitro und in vivo detailliert zu analysieren. Dazu wurden Transkripte, die zu verschiedenen Zeitpunkten während des lytischen Zyklus exprimiert werden (BZLF1 [immediate early], BALF5 [early], BLLF1 [late]) und latente Transkripte, die die unterschiedlichen in der Literatur beschriebenen Latenzformen repräsentieren (EBNA1, EBNA2, LMP1), ausgewählt. Da nicht alle dieser Transkripte gespleißt sind, wurde eine Methode, mit der zuverlässig DNA-freie RNA präpariert werden kann, etabliert, so daß keine sequenzbasierte Unterscheidung von RNA und DNA notwendig war. Um die Methode auch im Rahmen von Routine-Untersuchung einsetzbar zu machen wurde die Zuverlässigkeit und Reproduzierbarkeit aller Arbeitsschritte eingehend geprüft.
In verschieden EBV-positiven Zelllinien konnte gezeigt werden, daß die latenten Gene stärker exprimiert werden als die lytischen Gene, was mit der Annahme, daß nur einige Prozent der Zellen in vitro spontan in den lytischen Zyklus eintreten, übereinstimmt.
Im Hauptteil der Arbeit wurde in Kombination mit serologischen Untersuchungen und der Detektion viraler DNA in Serum und isolierten Lymphozyten die virale Aktivität in gesunden Trägern und in Patienten mit EBV-assoziierten Erkrankungen detailliert untersucht.
Sowohl bei gesunden Trägern als auch bei Patienten unter Immunsuppression wurden alle untersuchten latenten Transkripte - wenn auch in unterschiedlichem Ausmaß - exprimiert. Im Gegensatz zu der Annahme, daß in ruhenden B-Zellen gesunder Träger nur EBNA1 und eventuell LMP2A exprimiert werden, konnten in einem Teil der Probanden auch EBNA2- und LMP1-Transkripte nachgewiesen werden. In ca. 10% der Proben fand sich außerdem BLLF1-mRNA, was für einen Übergang des Virus in den lytischen Zyklus in diesen Zellen spricht. Die postulierten Latenzformen und Expressionsmuster scheinen also nicht allgemeingültig zu sein.
Im Rahmen einer prospektiven Studie (47 Patienten nach Nieren- bzw. Stammzelltransplantation, Beobachtungszeitraum 12 Monate) konnte bei Immunsupprimierten häufiger als in gesunden Trägern virale DNA in Lymphozyten nachgewiesen werden. Die Expression lytischer Gene war jedoch in beiden Kollektiven vergleichbar. Unterschiede zeigten sich in der Expression der latenten Gene, die unter Immunsuppression stärker exprimiert waren. Dies läßt den Schluß zu, daß die erhöhte Viruslast bei Patienten unter Immunsuppression nicht auf eine lytische Replikation des Virus, sondern vielmehr auf eine Expansion latent infizierter B-Zellen zurückzuführen ist. Keiner der 47 Patienten entwickelte während des Beobachtungszeitraumes eine EBV-assoziierte Lymphoproliferation; leicht erhöhte virale Aktivität reicht also als prognostischer Marker für eine PTLD nicht aus.
Sowohl bei Patienten unter Immunsuppression als auch bei gesunden Trägern schwankten die Titer EBV-spezifischer Antikörper stark im zeitlichen Verlauf. Ein Zusammenhang zwischen Antikörper-Titern und EBV-assoziierten Komplikationen nach Transplantation �wie er in der Literatur diskutiert wird- konnte nicht gezeigt werden.
Bei ausgewählten Patienten wurde außerdem die EBV-spezifische T-Zell-Antwort untersucht. Die Zahl spezifischer T-Zellen schwankte auch bei gesunden Trägern im zeitlichen Verlauf stark. Aus diesem Grund ist eine einmalige Untersuchung der T-Zell-Antwort nicht aussagekräftig. Die Untersuchungen an immunsupprimierten Patienten wurden deshalb über einen Zeitraum von einigen Monaten durchgeführt. Bei allen untersuchten Patienten konnten einige Wochen bzw. Monate nach Transplantation EBV-spezifische T-Zellen nachgewiesen werden. Die Zahl der spezifischen cytotoxischen T-Zellen unterschied sich dabei nicht von der in gesunden Trägern. Man kann also davon ausgehen, daß auch unter der heute üblichen Immunsuppression EBV in den meisten Fällen immunologisch kontrolliert werden kann.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Epstein-Barr virus shows a high prevalence with more than 95% of the adult population being infected with the virus. After primary infection the virus establishes a life-long latency in resting memory B-cells. In healthy carriers reactivation and shedding of the virus in the oropharynx are frequent events. However, due to immunological control mechanisms extensive viral replication and ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
Epstein-Barr virus shows a high prevalence with more than 95% of the adult population being infected with the virus. After primary infection the virus establishes a life-long latency in resting memory B-cells. In healthy carriers reactivation and shedding of the virus in the oropharynx are frequent events. However, due to immunological control mechanisms extensive viral replication and proliferation of latently infected B-cells are prevented.
Under immunosuppression (e.g. after organ transplantation) this immunological balance can be disturbed leading to enhanced viral reactivation and in several percent of the patients to post-transplant lymphoproliferative disease (PTLD).
Sensitive real-time PCR-systems were established for quantitation of viral mRNAs expressed during lytic replication or latency, respectively, for detailed analysis of viral expression-patterns both in vitro and in vivo. Transcripts were chosen that are expressed at different time-points of the lytic cycle (BZLF1 [immediate early], BALF5 [early], BLLF1 [late]) or that represent latent expression-patterns described in the literature (EBNA1, EBNA2, LMP1). As not all viral transcripts are spliced and sequence-based discrimination between viral RNA and DNA is therefore not possible, methods for isolation of DNA-free RNA were optimized in order to quantitate unspliced mRNA. The new RT-PCR-methods can also be used in routine-diagnostic procedures as reliability and reproducibility of all steps of the protocol were extensively analyzed.
With these PCR-systems viral expression was characterized in different EBV-positive cell lines showing that latent genes are more abundantly expressed than lytic genes supporting the assumption that only a small fraction of the cells spontaneously enters the lytic cycle in vitro.
This work focussed mainly on the detailed analysis of viral activity in healthy carriers and patients with EBV-associated disease using serological markers, new sensitive methods for quantitation of viral load in serum and isolated PBMC (peripheral blood mononuclear cells) and quantitation of viral gene expression.
It was shown that both in healthy carriers and in patients under immunosuppression expression of viral lytic genes can be detected. In contrast to the published assumption that in resting B-cells of healthy carriers only EBNA1 and in some cases LMP2A are expressed, not only EBNA1- but also EBNA2- and LMP1-mRNA could be detected in a substantial fraction of the samples. In approx. 10% of the samples mRNA of the lytic gene BLLF1 was shown indicating lytic replication in these patients. The published expression patterns and types of latency should therefore be reviewed critically.
In a prospective study with 47 patients after renal or stem cell transplantation viral DNA was detected in these patients more often than in healthy controls during the 12 months follow-up. However expression of lytic genes was comparable in both groups with detectable levels of BLLF1-mRNA in approx. 10% of the samples. In contrast expression of latent viral genes was clearly elevated under immunosuppression. This indicates that the elevated viral load in patients after transplantation is due to proliferation of latently infected B-cells rather than to lytic replication of the virus. This slightly elevated viral load is however not predictive for EBV-associated complications as none of the 47 patients showed signs of EBV-associated PTLD during the follow-up.
Fluctuations of titers of EBV-specific antibodies have been discussed as markers for EBV-associated disease in patients after transplantation. Our study however showed significant variations of antibody-titers over time in patients under immunosuppression as well as in healthy carriers. These fluctuations seem therefore not to be related with EBV-associated disease.
In addition EBV-specific cytotoxic T-cells were analyzed in selected patients. As the number of specific T-cells varies substantially in healthy carriers and is not constant over time it is necessary to monitor EBV-specific T-cells over time. In all patients under immunosuppression EBV-specific T-cells could be detected several weeks or months after transplantation usually in numbers similar to those observed in healthy carriers.
In conclusion our data indicates that under modern immunosuppression EBV is usually controlled effectively by the immune system.
Metadaten zuletzt geändert: 26 Nov 2020 13:05
Nur für Besitzer und Autoren: Kontrollseite des Eintrags
Downloadstatistik