| License: Publishing license for publications excluding print on demand (1MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-2912
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.10121
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Date: | 15 September 2003 |
| Referee: | Ralf Wagner |
| Date of exam: | 24 July 2003 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene Biology, Preclinical Medicine |
| Keywords: | HIV , Replikation , Lebendimpfstoff , Codon , Grün fluoreszierendes Protein , Gag-Proteine , INS , HIV , Replication , live-attenuated vaccines , codon , green fluorescend protein , Gag |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 10121 |
Abstract (German)
In dieser Arbeit konnte unsere Theorie über die Regulation der späten HIV-1 Expression weiter belegt werden (Marcus Graf, 2000). Wir vermuten, dass die Kontrolle der Rev-abhängigen HIV-Transkripte von der Anwesenheit des 5´-Spleißdonor (SD) abhängig und die zelluläre Spleißmaschinerie an dem Kontrollprozeß beteiligt ist. Darüber hinaus konnten wir zeigen, dass der 5´-SD zur nukleären ...
Abstract (German)
In dieser Arbeit konnte unsere Theorie über die Regulation der späten HIV-1 Expression weiter belegt werden (Marcus Graf, 2000). Wir vermuten, dass die Kontrolle der Rev-abhängigen HIV-Transkripte von der Anwesenheit des 5´-Spleißdonor (SD) abhängig und die zelluläre Spleißmaschinerie an dem Kontrollprozeß beteiligt ist. Darüber hinaus konnten wir zeigen, dass der 5´-SD zur nukleären Stabilisierung der INS ("instability or inhibitory sequences")-haltigen RNA notwendig ist.
Anhand chimärer gag-HIV-Konstrukte, in denen bestimmt Sequenzbereiche an die Kodonwahl von hochexpremierenden Säugetiergenen angepaßt wurden, konnte hier dargestellt werden, dass die 5´-Hälfte des gag-Genes für die niedrige Pr55gag-Expressionsrate mit wtgag transfizierten Zellen verantwortlich ist. Die Gag-Repression ist auf einen additiven inhibitorischen Effekt innerhalb der wtgag-Sequenz zurückzuführen. Die inhibitorische Sequenzmotive innerhalb von wtgag benötigen für ihre starke destabilisierende Wirkung das RR(Rev responsive)-Element. Bei der Charakterisierung der INS Elemente von wtgag konnte gezeigt werden, dass ihre Funktion nicht über die ARE- (A/U-rich elements, 5´-UAAAU-3´) bzw. hnRNP A1-(5´-UAGGGA-3´) Bindestellen vermittelt wird. Zudem konnte dargestellt werden, dass die mehrfach beobachtete Beteiligung von SC35 (5´-UGCNGYY-3´ / 5´-AGCAG-3´) und SF2/ASF (5´-RGAAGAAC-3´ / 5´-SRSASGA-3´) an der Regulation der späten HIV-Transkripte zumindest nicht über diese Motive innerhalb der wtgag-RNA vermittelt wird. Anhand Computeranalysen wurde hier zum ersten Mal beschrieben, dass in der Studie von Schneider alle Sam68 (68-kDa Scr-associated substrate during mitosis) (5´-UAAA-3´)-Bindestellen in der wtgag-Sequenz zerstört wurden (Schneider et al., 1997). Desweiteren konnte gezeigt werden, dass die gestörte Funktion von Rev in murinen Zellen auf den Zelltyp und auf Faktoren zurückzuführen sind, die am 5´-Ende der gag-RNA binden.
Um zu bestätigen, dass sowohl der 5´-SD als auch der A/U-Reichtum der HIV-Transkripte die minimalen Voraussetzungen für ihre Kernretention und die Rev-abhängige Expression darstellen, wurden in der Diplomarbeit von Sylvia Kehlenbeck ein GFP-Reporterkonstrukt entworfen, welches in seinem Kodongebrauch an den des HIV-1 Genoms (hivGFP) angepaßt wurde (Sylvia Kehlenbeck, 2000). In Transfektionsstudien erwies sich die hivGFP-RNA in Anwesenheit des 5´-SD als stabil im Zellkern und konnte nach Bereitstellung des Rev/RRE-Systems auch im Zytoplasma nachgewiesen werden.
Um zu überprüfen, inwieweit "kryptische" SD als CRS ("cis-acting repressor sequences") die Rev-Abhängigkeit viraler RNAs bestimmen und bei der Regulation der hivGFP-Expression zum Tragen kommen, wurde ein Plasmid entworfen, indem sowohl alle "konsensus" als auch alle "kryptischen" SD innerhalb von hivGFP mutiert wurden. Anhand dieser Studie konnte dargestellt werden, dass "kryptische" SD nicht für die HIV-typische Abhängigkeit der Genexpression von hivGFP (Anwesenheit der cis- (UTR, RRE) und trans-aktiven (Rev) Elemente) verantwortlich sind.
Mit einer weiterführenden Studie konnte gezeigt werden, dass auch nicht der reine A/U-Gehalt der Transkripte für die HI-virale Regulation ursächlich ist. Dies ist ein weiterer Beleg dafür, dass die Replikation von HIV auch anhand von definierbaren, bisher aber kaum charakterisierten, cis-aktiven Elementen reguliert wird.
In Analogie zu den chimären gag-Konstrukten, wurden drei chimäre HI-Proviruskonstrukte erzeugt. Damit konnte erstmals im proviralen Umfeld gezeigt werden, dass Sequenzmodifikationen am 5´-Ende des HI-viralen Genoms einen Einfluß auf die Virusreplikation haben. Der gestörte Vermehrungszyklus der chimären Proviren korreliert dabei mit einer zum Wildtyp andersartigen RNA-Synthese, als auch unterschiedlicher RNA- und Protein-Prozessierung. Die niedrige Expressionsrate der späten HIV-Gene der 5´-kodonmodifizierten Proviren kann dabei auf RNA-Ebene zurückgeführt werden. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass HI-Provirusmutanten, die am 5´-Ende Sequenzmodifikationen beinhalten, nicht mehr nachweisbar replizieren können. Dies kann (i) auf eine fehlerhafte Prozessierung von Gag, die zu einem gestörten bzw. keinem Einbau von Env in die korrespondierenden Viruspartikel führt, basieren, (ii) auf das Fehlen des trans-aktiven viralen p40-Proteins begründet liegen und/oder (iii) auf eine gestörte reversen Transkription zurückgeführt werden. Der chimäre Provirus mit der kodonoptimierten Sequenz am 3´-Ende von gag zeigt gegenüber zum Wildtyp eine nur leicht verzögerte Replikation mit einer reduzierten p24-Produktion. Damit steht dieser Provirus unter keinem Selektionsdruck, weshalb bei ihm keine manifestierte Rückmutation zur Wildtyp-Sequenz zu beobachten war.
Die Ergebnisse dieser Studie können hilfreich sein, einen in seiner Virulenz eingeschränkten HI-Provirus zu erzeugen, der die Grundlage für die Produktion attenuierter Lebendimpfstoffe darstellt.
Translation of the abstract (English)
Although it is well accepted that the time-regulated expression of HIV-1 un- and single-spliced transcripts depends on REV/RRE function, the contribution of splice sites, proposed negatively acting sequence elements (INS) and rare - AT rich - codon usage in late viral transcripts on nuclear retention and REV-dependent translocation of late viral RNAs is still unclear. Accordingly, a major goal of ...
Translation of the abstract (English)
Although it is well accepted that the time-regulated expression of HIV-1 un- and single-spliced transcripts depends on REV/RRE function, the contribution of splice sites, proposed negatively acting sequence elements (INS) and rare - AT rich - codon usage in late viral transcripts on nuclear retention and REV-dependent translocation of late viral RNAs is still unclear. Accordingly, a major goal of this study is to determine the potential influence of codon usage on timely regulated gene expression during HIV replication.
In order to investigate the nature and location of proposed INS chimeric constructs have been generated, which contain different portions of wildtyp and codon-optimized gag sequences. In transient gag expression studies performed in different cell-lines show that the position of wt-sequences had a major influence of gag expression. However they were no clear correlation between AU-content of the chimeric gene and gag product. Inhibitor studies with RevM10 show in Northern blot assays only an influence to the nuclear export of the chimeric constructs (containing 5´ UTR and 3´ RRE), which include at the 5´ end wildtyp sequences. The transport of the construct which have the most part of wildtyp sequence can be totally inhibit with RevM10. Taken together the data provide evidence that Rev dependency and timely regulated nuclear export of HIV-1 unspliced pre-mRNAs is determined by a combination of both, INS elements and splice site usage.
As we have recently shown, wildtype gag transcripts essentially required the presence of the functional HIV-1 major splice donor (SD) to be protected from rapid nuclear degradation. The addition of the RRE/REV system to gag-derived reporter constructs allowed the CRM1/Exportin dependent nuclear translocation of late viral RNAs into the cytoplasm that was followed by expression of the Gag precursor. These genetic rules could readily be applied to the GFP gene that was rendered REV/CRM1 dependent by (i) adopting the codon usage to HIV, (ii) adding the 5'-untranslated region and (iii) fusing the RRE to the 3' end of the modified GFP gene.
The HIV-1 regulatory protein Rev is absolutely required for the production of viral structural proteins. Splice sites have been seen to function as cis-acting repressor sequences (CRS) and inhibit expression of the Rev-dependent RNAs.
For some years ago a cryptic splice site in gag was found. The cryptic site is 5/9 to the consensus sequence and located immediately downstream of the initiation codon (ATG) for Gag. Analysis of the RNA product containing the cryptic splice donor revealed that the Rev was required for the cytoplasmic accumulation of unspliced RNA, while spliced RNA was Rev independent. Transfection of a wild-type construct also demonstrated usage of the cryptic splice donor. The findings suggest the potential for cryptic splice sites to serve as CRS in the determining the Rev dependence of viral RNAs.
In order to analyze the role of splice donor in Rev dependence of HIV-1 RNAs a GFP-construct on the basis of hivGFP have been created, which have all splice donor sites delated (delSDhivGFP). When the splice donor sites have an important role by the regulated transport of Rev-dependent RNAs and the AU-content nearly no influence (hivGFP: 69 % AU - delSDhivGFP: 66 % AU), the expression of this construct have to be independent of Rev. But the study show, that the expression of delSDhivGFP was Rev-dependent. Therefore cryptic splice site and the AU-content have no contribute to the HI-viral gene expression.
Chimeric HI-provirus mutants have been also established in which extended regions within the gag gene were substituted by sequences displaying GC-rich codon usage found in frequently expressed mammalian genes. Some of the established mutants either showed severe defects in the replicative capacity or turned out to be completely non-infectious. Although neither the encoded amino acid sequence, nor any of so far known cis-acting elements were altered, expression of Env and/or Gag in transfected cells was severely affected in these cases. This observation correlated with obvious alterations in the levels of un- and singly spliced RNAs as compared to the parental provirus that are suggested to account for the defects or loss in viral replication. These studies strengthen our current view that the codon usage in concert with cis- (RRE) and trans-acting (Rev) elements is important for regulating lentiviral gene expression.
Moreover, these observations had significant impact on the development of innovative REV-independent DNA vaccines and lentiviral gene therapy vectors fulfilling highest safety standards.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 13:41
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