The main focus of this work was to develop high-throughput and multiplex assays for the fast and efficient analysis of sequence variations in the gene coding for the ATP-binding cassette transporter 1 (ABCA1), which has recently been identified as the main regulator of plasma HDL cholesterol.
Intensive literature and data base research was performed to library all known sequence variations in this gene. Relevant data of subjects with HDL deficiency syndrome were archived, which carry mutations in this gene. These data were stored in a web page archive (www.abca1-mutants.all.at) to provide an information resource for further research in ABCA1.
A knowledge-based sequencing approach was performed to identify novel sequence variations in ABCA1. In the promoter region, two novel VNTR polymorphisms at a ZNF202 and a SRY binding-site were identified along with three novel SNPs (G1047C, C1152T and C1440T). While the VNTR polymorphisms might not be of functional relevance, the three SNPs were found in significantly different distribution of genotypes in some cohorts and all three nucleotide exchanges appear to be associated to low HDL. Six novel sequence variations affecting amino acid sequence, including the V771M polymorphism, were found in patients with HDL deficiency syndrome and probands with aberrant HDL-levels.
LightCycler and TaqMan assays were developed for the detection of common single nucleotide polymorphisms of potential interest in the ABCA1 gene, including the V771M polymorphism. An automated high-throughput workflow with implemented TaqMan technology was established for fast and efficient genotyping of single nucleotide polymorphisms in large cohorts capable of 40,000 analyses per 24 hours. With the newly established workflow, several polymorphisms were genotyped and evaluated, including the R219K and the V771M variation. The R219K polymorphism was found in significantly increased prevalence in Italian centenarians compared to healthy Italian controls, indicating a protective effect of K219 in aging. This confirms findings from other groups concerning this polymorphism. The novel V771M polymorphism was found with significantly decreased abundance in Hungarian CAD patients compared to healthy Hungarian blood donors, indicating a protective effect of M771 on CAD. All other frequency data showed no significant difference compared to the control groups.
A multiplex assay was established for the simultaneous detection of four important polymorphisms in the ABCA1 gene using allele specific primer extension reaction for discrimination of SNP. The method uses zip- and color-coded beads for detection with flow cytometry (Luminex). The new assay provides a fast and cost-efficient method for the determination of single nucleotide polymorphisms with reliability comparable to the well-established TaqMan technology.

Im Mittelpunkt dieser Arbeit stand die Entwicklung von Hochdurchsatz- und Multiplex- Assays für die schnelle und effiziente Analyse von Sequenzvariationen am Modellsystem des ATP-bindenden Cassetten Transporter A1 (ABCA1)-Gens, das als wichtigster Regulator von HDL Cholesterin im Plasma identifiziert wurde.
Zunächst wurden in einer intensiven Literatur- und Datenbank-Recherche alle für dieses Gen bekannten Sequenzvariationen katalogisiert und relevante Daten von Patienten mit HDL Defizenz Syndrom, die Träger von bekannten Mutationen in ABCA1 sind, archiviert. Diese Informationen, die einer weiteren Forschung mit ABCA1 dienen sollen, wurden auf einer Internetseite (www.abca1-mutants.all.at) zusammengestellt.
Anschließend wurde ein wissensbasierter Sequenzierungsansatz durchgeführt, um gezielt neue Sequenzvariationen in ABCA1 zu finden. Hier wurden im Promotorbereich neben zwei neuen VNTR Polymorphismen auf einer ZNF202- und einer putativen SRY-Bindungsstelle, drei neue SNPs (G1047C, C1152T und C1440T) identifiziert. Während den beiden VNTR Polymorphismen eine eindeutige funktionelle Relevanz nicht nachzuweisen war, wurde bei den drei SNPs eine signifikant unterschiedliche Verteilung der Genotypen in mehreren Kollektiven festgestellt. Alle drei Einbasenaustausche scheinen mit niedrigen HDL-Werten assoziiert zu sein.
Sechs neue Sequenzvariationen die zu Aminosäureaustauschen führen (unter anderem V771M) wurden in Patienten mit HDL Defizienz Syndrom und Probanden mit anomalen HDL-Werten gefunden. Für diese und andere häufig auftretende SNPs von potentieller Relevanz wurden Assays für LightCycler und TaqMan entwickelt.
Ein automatisierter Hochdurchsatz-Workflow basierend auf TaqMan Technologie konnte erfolgreich etabliert werden, der eine schnelle und effiziente Genotypisierung von großen Patientenkollektiven (bis zu 40.000 Analysen in 24 Stunden) ermöglicht. Mit dem etablierten Workflow wurden mehrere Polymorphismen in verschiedenen Kollektiven genotypisiert, unter anderem die Aminosäureaustausche R219K und V771M. Der Austausch R219K wurde in signifikant unterschiedlicher Verteilung in italienischen über einhundertjährigen Senioren im Vergleich zu italienischen Blutspendern gefunden, was auf einen protektiven Effekt im Alterungsprozess schließen läßt. Dies ist übereinstimmend mit anderen Assoziationsstudien für diesen Polymorphismus. Der neue Polymorphismus V771M wurde signifikant weniger häufig in ungarischen CAD Patienten im Vergleich zu ungarischen Blutspendern gefunden, was auf einen protektiven Effekt des M771-Allels in der Entwicklung von CAD schließen läßt. Alle anderen Genotypisierungen zeigten keine signifikant unterschiedliche Verteilung zwischen den einzelnen Kohorten und den Kontrollkollektiven.
Weiterhin wurde ein neues Verfahren zur multiplexen SNP Analytik auf der Basis der Luminex-Technologie etabliert. Mit Hilfe von allelspezifischer Primerextension konnten vier Polymorphismen von potentieller Relevanz simultan analysiert werden. Diese durchflusszytometrische Methode nutzt Zip-code-Technik und fluoreszenzmarkierte Beads. Das neue Assaysystem erlaubt die schnelle und effiziente Genotypisierung von SNPs mit einer Genauigkeit vergleichbar mit der anerkannten TaqMan Technologie.