Fas Ligand-exprimierende humane dendritische Zellen zur Induktion von T-Zelltoleranz: Phänotypische und funktionelle Charakterisierung

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Hoves, Sabine

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Date of publication of this fulltext: 27 Apr 2004 15:34

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Item type:	Thesis of the University of Regensburg (PhD)
Date:	26 April 2004
Referee:	Charalampos (Prof. Dr.) Aslanidis
Date of exam:	25 February 2004
Institutions:	Biology, Preclinical Medicine
Keywords:	Apoptosis , Immuntoleranz , Fas-Ligand , Dendritische Zelle , , dendritic cell , Fas ligand , tolerance , apoptosis
Dewey Decimal Classification:	500 Science > 570 Life sciences
Status:	Published
Refereed:	Yes, this version has been refereed
Created at the University of Regensburg:	Yes
Item ID:	10194

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Abstract (German)

Abstract (German)

Die Aktivierung auto- oder alloreaktiver T-Zellen durch DC gilt als wesentlicher pathogenetischer Schritt zahlreicher Autoimmunerkrankungen bzw. Transplantat-Abstoßungsreaktionen. Die Therapieoptionen bei diesen T-zellabhängigen Erkrankungen beschränken sich bisher auf die Gabe von unspezifisch wirkenden Immunsuppressiva, die das Immunsystem generell unterdrücken und deshalb zum Teil schwere Nebenwirkungen wie opportunistische Infektionen oder Tumorerkrankungen verursachen können. Wünschenswert wäre dagegen die selektive Ausschaltung reaktiver T-Lymphozyten, d. h. die Induktion einer antigenspezifischen T-Zelltoleranz. In zahlreichen Tiermodellen und in vitro Experimenten mit Zelllinien konnte gezeigt werden, dass der Einsatz Fas Ligand- (FasL- oder CD95L-) exprimierender antigenpräsentierender Zellen (APC-FasL) eine vielversprechende Therapieoption darstellt. Ähnliche Untersuchungen mit primären humanen APC-FasL wurden bisher jedoch noch nicht durchgeführt. Ziel der vorliegenden Arbeit war deshalb die Generierung humaner FasL-exprimierender APC durch adenoviralen Gentransfer und die Analyse der immunregulatorischen Funktionen dieser Zellen. Hierzu wurden DC aus primären humanen Monozyten in vitro differenziert und in Kokultivierungsexperimenten mit T-Lymphozyten eingesetzt. Wegen der schlechten Vermehrungseffizienz adenoviraler Vektoren, die apoptoseinduzierende Gene kodieren, wurden Vektorkonstrukte verwendet, die eine induzierbare FasL-Expression unter Kontrolle des Cre/loxP-Vektorsystems ermöglichten. Durch die Expression des FasL-Gens wurden unreife DC durch Fas-vermittelte Apoptose ausgeschaltet, während reife DC (mDC) davor geschützt waren. Die adenovirale Transduktion der DC mit dem Kontrollvektor AdEGFP oder mit FasL (mDC-FasL) verursachte keine Änderung des DC-Phänotyps. Die Funktionalität der mDC-FasL wurde in verschiedenen Kokultivierungsmodellen mit T-Zellen getestet. Zunächst wurden Fas-exprimierende Jurkat T-Zellen verwendet, die durch mDC-FasL besonders effizient eliminiert werden konnten. Die Apoptoseinduktion war abhängig vom Zellkontakt und konnte durch einen FasL-blockierenden Antikörper konzentrationsabhängig unterbunden werden. Untersuchungen mit primären humanen T-Lymphozyten zeigten, dass diese erst nach Aktivierung durch mDC-FasL eliminiert werden konnten, während ruhende T-Lymphozyten vor dem Apoptosesignal geschützt waren. Dabei wurde in polyklonal aktivierten CD4+ und CD8+ T-Zellen gleichermaßen Apoptose induziert. In einem allogenen Stimulationsmodell wurde gezeigt, dass mDC-FasL ebenfalls allogen aktivierte T-Zellen effizient eliminieren konnten. Ein Ausblick auf weitere Untersuchungen von mDC-FasL in einem autologen System zur antigenspezifischen Deletion von T-Lymphozyten wurde dargestellt und die Vorteile und Risiken des Einsatzes von mDC-FasL als potenzielle Therapieoption T-zellabhängiger Erkrankungen diskutiert.

Translation of the abstract (English)

Serveral in vitro and animal studies have been performed in order to modulate the interaction of antigen presenting cells (APC) and T lymphocytes by Fas signaling to delete activated T cells in an antigenspecific manner. These studies support the concept to apply Fas ligand (FasL) expressing APC (APC-FasL) as a novel strategy for the treatment of T cell dependent autoimmune disease and allograft rejection. However, comparable studies with human APC-FasL are still lacking. Due to difficulties in propagation of vectors carrying suicide genes, an inducible Cre/loxP adenovirus vector system was used for transduction of monocyte-derived human dendritc cells (DC) to express FasL. Transduction of immature DC with FasL resulted in massive self destruction, while mature DC (mDC) were protected from Fas-meditated apoptosis despite expression of Fas and could be used for further studies. Transduction of mDC with the control vector AdEGFP or with FasL (mDC-FasL) did not affect the characteristic mature DC phenotype. Functional analysis of mDC-FasL was studied in different coculture models using T cells. First, experiments with the Fas+ Jurkat T cell line were performed revealing that mDC-FasL were able to eliminate Jurkat T cells very efficiently, which was due to induction of apoptosis. Apoptosis in Fas+ target cells required cell-to-cell contact with APC-FasL and could be inhibited by a blocking anti-FasL antibody in a dose dependent fashion. Using primary human T lymphocytes in a second coculture model, it could be demonstrated that only activated but not resting T cells were eliminated by Fas-mediated apoptosis. Activated primary human CD4+ and CD8+ T lymphocytes could be equally eliminated by mDC-FasL. In addition, allogeneic activated T cells were also killed by mDC-FasL. Future studies using an autologous coculture modell to analyze elimination of T lymphocytes in an antigenspecific manner by mDC-FasL were presented. Advantages of DC-FasL in immunotherapy of T cell-dependent diseases and the possible risks were discussed.

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