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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-3547
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Date: | 6 December 2004 |
| Referee: | Hans-Robert (Prof. Dr. Dr.) Kalbitzer |
| Date of exam: | 5 February 2004 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Prof. Dr. Dr. Hans Robert Kalbitzer |
| Keywords: | Onkologie , Nährstoffversorgung , Brustkrebs , Cytologie , Tight Junctions , Claudin-1 , Brusttumorgenese , RAR/RXR Rezeptoren , Chromatinkondensation , Claudin-1 , Tight Junctions , breast tumorigenesis , RAR/RXR receptors , chromatin condensation |
| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 10241 |
Abstract (German)
Integrale Membranproteine der Claudin-Familie stellen die funktionellen Hauptkomponenten des Tight Junction Komplexes in normalen epithelialen und endothelialen Geweben dar. In ontogenetisch unterschiedlichen, epithelialen Tumoren wurden jedoch abberante Tight Junction Strukturen sowie eine dysregulierte Expression und Membranlokalisation Tight Junction assoziierter Proteine nachgewiesen. Dies ...
Abstract (German)
Integrale Membranproteine der Claudin-Familie stellen die funktionellen Hauptkomponenten des Tight Junction Komplexes in normalen epithelialen und endothelialen Geweben dar. In ontogenetisch unterschiedlichen, epithelialen Tumoren wurden jedoch abberante Tight Junction Strukturen sowie eine dysregulierte Expression und Membranlokalisation Tight Junction assoziierter Proteine nachgewiesen. Dies führte zu der Hypothese, daß der Expressionsverlust von Tight Junctions zu einer verbesserten parazellulären Diffusion von Nährstoffen und Wachstums-faktoren in soliden Tumoren beiträgt und damit einen entscheidenden, fördernden Schritt in der Tumorprogression darstellt.
Etwa zeitgleich mit der Beschreibung des homologen, murinen Claudin-1 Moleküls wurde 1998 das humane Claudin-1 Gen mit Hilfe der Differential Display Technik identifiziert. Northern-Blot Untersuchungen zeigten, daß die Claudin-1 mRNA Expression in einer Reihe von Brusttumor-zellinien im Vergleich zu normalen Brustepithelzellen stark verringert oder nicht mehr nachweisbar war. Funktionelle Studien deuteten darauf hin, daß Claudin-1 in normalen Epithelien eine wesentliche Komponente von Tight Junctions darstellt, die zu einer Inhibition der parazellu-lären Ionen- und Molekülpassage führt. In einer in vivo Prävalenzanalyse wurde zusätzlich nach-gewiesen, daß die physiologische Claudin-1 Expression und Membranlokalisation normaler Brustepithelzellen in eine rein zytoplasmatische Lokalisation in differenzierten Brusttumorzellen übergeht und sich in stark dedifferenzierten Brusttumorzellen fast vollständig verliert. Die Sequenzanalyse des Claudin-1 Gens in Brusttumoren und Brusttumorzellinien ergab keine signifikanten Mutationen der Claudin-1 Gensequenz sowie promotornaher Sequenzbereiche, was darauf hindeutet, daß epigenetische Faktoren am Expressionsverlust von Claudin-1 in der Brust-tumorgenese beteiligt sind.
Im Rahmen dieser Arbeit sollte die zellphysiologische Bedeutung von Claudin-1 in der Brusttu-morgenese sowie mögliche am Expressionsverlust von Claudin-1 in Brusttumorzellen beteiligte epigenetische Regulationsmechanismen untersucht werden. Um die Bedeutung des Verlust der Claudin-1 Expression und Membranlokalisation in der Brusttumorgenese zu verstehen, wurden Claudin-1 negative und Claudin-1 retroviral transduzierte Brusttumorzellen phänotypisch in Monolayerkulturen, Sphäroiden und Xenograft-Modellen analysiert. Um eine Überlagerung des Phänotyps der Claudin-1 Reexpression mit anderen Claudinen möglichst zu vermeiden, wurde für die physiologischen Studien MDA-MB 361 als Zellmodell gewählt, in denen weder Claudin-1, -2, -3, -4 noch Occludin nachgewiesen werden konnte. Für die Untersuchungen zur epigenetischen Expressionskontrolle kamen zusätzlich sieben Brusttumorzellinien mit unterschiedlichem Expressions- und Lokalisationsmuster von Claudin-1, -3 und -4 zur Anwendung.
Die detaillierte Analyse des Expressionsstatus von Claudin-1 in verschiedenen differenzierten Brusttumorzellinien ergab eine hohe Expression in einer Zellinie, eine stark reduzierte Expression in fünf und nicht detektierbare Claudin-1 mRNA und Proteinexpression in zwei von acht unter-suchten Brusttumorzellmodellen. In der vorliegenden Arbeit konnte mit nativ Claudin-1 positiven Zellen erstmals gezeigt werden, daß die Claudin-1 Proteinsynthese sowie der gerichtete Membrantransport offensichtlich primär posttranskriptionell und nicht transkriptionell in Abhän-gigkeit etablierter Zell-Zellkontakte reguliert wird.
Für die zellphysiologischen Studien wurden retroviral Claudin-1 transduzierte MDA-MB 361 Zellinien mit unterschiedlicher zellulärer Lokalisation verwendet, die ein dem klinischen Expres-sionsbild ähnliches zelluläres Claudin-1 Lokalisationsmuster wie in normalem Brustepithel- und Brusttumorgewebe aufwiesen. Während in Claudin-1 negativen MDA-MB 361 Zellen keine Tight Junction Strukturen gefunden wurden, führte die Claudin-1 Reexpression zu einer Rekonstitution kontinuierlicher Tight Junction ähnlicher Strangstrukturen an Zell-Zellkontakten und abhängig von der Qualität der Claudin-1 Membranlokalisation zu einer parazellulären Fluxinhibition für Moleküle bis 0.3 bis 40 kDa. Es konnte nachgewiesen werden, daß die Reexpression von Claudin-1 in MDA-MB 361 Zellen keinen Einfluß auf die Proliferations- und Zelltodrate in 2D Mono-layerkulturen hat. In 3D Sphäroidkulturen fand sich jedoch unabhängig von der Sphäroidgröße in MDA-MB 361 Sphäroiden mit membranständiger Claudin-1 Expression eine signifikant erhöhte Zahl toter Zellen in zentralen Sphäroidbereichen sowie eine erhöhte Apoptoserate im Vergleich zu Claudin-1 negativen und Claudin-1 positiven Sphäroiden mit vorwiegend zytoplasmatischer Claudin-1 Lokalisation. Tierstudien mit SCID-Mäusen ergaben, daß die Expression von Claudin-1 in Verbindung mit Membranlokalisation in MDA-MB 361 Xenografttumoren ebenfalls zu einer deutlich erhöhten Zelltod- und Apoptoserate, einer signifikanten Reduktion des Tumorwachs-tums um ca. 60 % sowie einer deutlich verlängerten Überlebenszeit der Mäuse verglichen mit den Kontrollgruppen führte. Diese an einem Brusttumormodellsystem erzielten Ergebnisse zeigen erstmals, daß dem Verlust der Expression und/oder Membranlokalisation von Claudin-1 in vivo eine wichtige Bedeutung in der Tumorprogression zukommt.
Als Ursachen für die Inaktivierung oder Verringerung der transkriptionellen Aktivität von Claudin-1 in Brusttumorzellen kamen unter anderem die Methylierung des Claudin-1 Promotors, die fehlende Aktivität von Transkriptionsfaktoren oder Signalkaskaden sowie eine Repression der Claudin-1 Genexpression aufgrund von Chromatinkondensation in Betracht. Die Untersuchungen ergaben keine Hinweise auf eine Methylierung der Claudin-1 Promotorsequenz. Ebensowenig konnte ein Zusammenhang einer erhöhten Ras-Aktivität und dem Ras-MEK-ERK Signal-transduktionsweg mit der Regulation von Claudin-1 sowie der Tight Junction Diffusionsbarriere in Brusttumorzellen nachgewiesen werden. Um die Bedeutung des Retinoid-Rezeptorsignalwegs und der Chromatinkondensation für die trankriptionelle Repression von Claudin-1 in der Brusttumorgenese zu untersuchen, wurden acht verschieden differenzierte Brustumorzellinien mit Retinoiden und Histondeacetylase-Inhibitoren unterschiedlicher Wirkspezifität behandelt. Dabei zeigte sich, daß sowohl der Retinoid-Rezeptorsignalweg als auch die Chromatinstruktur für die Regulation der Claudin-1 Expression in Brusttumorzellen bedeutsam sind. Da die untersuchten Zellmodelle jedoch heterogen reagierten und die maximale Expressionshöhe nicht erreicht wurde liegt es nahe zu vermuten, daß zusätzliche außer den untersuchten Faktoren für den Expres-sionsverlust von Claudin-1 verantwortlich sein müssen. Die Ergebnisse der Aktivatoren- und Inhibitorstudien deuten desweiteren darauf hin, daß der Transkription und Translation sowie dem Membrantransport von Claudin-1 in Brusttumorzellen komplexe und möglicherweise voneinander unabhängige Regulationsmechanismen zugrundeliegen.
Insgesamt betrachtet unterstützen die in dieser Arbeit durchgeführten Studien die Hypothese, daß der Verlust der epithelialen parazellulären Permeationskontrolle zu einer verbesserten Stoff-diffusion führt und damit das Wachstum solider Tumore fördert. Somit wäre die Induktion eines eingeschränkten Stoffaustausches durch Rekonstitution funktioneller Tight Junctions in Tumoren zusätzlich zur Blockierung der Neovaskularisierung ein neues Konzept das Wachstum solider Tumore zu hemmen und somit von hoher therapeutischer Relevanz.
Translation of the abstract (English)
Integral membrane proteins of the claudin family are the major structural components of tight junctions (TJ) in normal epithelial and endothelial tissues. However, in several ontogenetically different epithelial tumors abberant TJ structures as well as dysregulated expression and/or membrane localization of TJ associated proteins has been identified. These data gave rise to hypothesize that loss ...
Translation of the abstract (English)
Integral membrane proteins of the claudin family are the major structural components of tight junctions (TJ) in normal epithelial and endothelial tissues. However, in several ontogenetically different epithelial tumors abberant TJ structures as well as dysregulated expression and/or membrane localization of TJ associated proteins has been identified. These data gave rise to hypothesize that loss of functional TJ expression leads to improved paracellular diffusion of nutrients and growth factors and therefore might be an important step for solid tumor develop-ment.
In 1998, in parallel with the identification of the murine claudin-1 molecule as a major TJ protein, the human claudin-1 gene was discovered by differential display analysis. Subsequent Northern-Blot analyses showed that normal breast epithelial cells express high levels of claudin-1 mRNA whereas low or undetectable claudin-1 mRNA expression was found in breast tumor cell lines. Functional studies revealed that claudin-1 is an essential component of TJs controlling the passage of ions and molecules through paracellular spaces in normal epithelium. In addition, in-vivo immunhistochemical studies showed that physiological membrane expression of claudin-1 in breast epithelial cells is lost in breast tumor cells where primarily cytoplasmic homing and/or downregulation of claudin-1 expression was found. Finally, sequence analyses of the claudin-1 gene in in-vivo breast tumors derived from patients and in in-vitro breast tumor cell models revealed no significant mutations in coding/promoter regions indicating that epigenetic factors might be responsible for an altered claudin-1 expression in breast tumorigenesis.
The aim of this work was to analyse the physiological relevance of claudin-1 in breast tumorigenesis and possible involved epigenetic regulatory mechanisms of claudin-1 expression in breast tumor cells. To understand the loss of claudin-1 expression and membrane localisation in breast tumorigenesis, phenotypic analyses using claudin-1 negative and positive retroviral transduced breast tumor cells were performed in monolayer cultures, 3D spheroids and in mouse xenograft models. The claudin-1 to -4 and occludin negative MDA-MB 361 cell line was chosen for physiological studies in order to omit masking of the claudin-1 phenotype by other TJ membrane components. In addition, analyses of epigenetic claudin-1 regulation was performed in 7 different breast cancer cell lines with varying degree of claudin-1, -3 and -4 expression and membrane localization.
Detailed analysis of the claudin-1 expression status in several different breast tumor cell lines revealed high levels in 1 cell line, reduced expression in 5 and undetectable levels of claudin-1 mRNA and protein expression in 2 of 8 different breast tumor cell models. Furthermore, it could be shown that in the claudin-1 positive T47-D cell line claudin-1 protein synthesis and membrane transport are regulated posttranscriptionally dependent on established cell-to-cell contacts.
In order to study the physiological effector function of claudin-1 in breast tumor cells claudin-1 transduced MDA-MB 361 cell lines with a comparable claudin-1 protein expression- and locali-zation pattern found in normal breast epithelium and breast tumor tissues were generated. Whereas no TJ structures could be detected in claudin-1 negative MDA-MB 361 mock control cells claudin-1 reexpression resulted in reconstitution of TJ-like fibrils at cell-to-cell contact sites and in correlation with the quality of claudin-1 membrane homing in paracellular flux inhibition of dextran molecules ranging from 0.3 to 40 kDa. Expression of claudin-1 had no effect on cell proliferation and cell death in 2D monolayer cultures. However, in 3D spheroid cultures signi-ficant increase of apoptotic cell death was observed primarily in the spheroid core regions of claudin-1 positive tumor spheroids that exhibit physiological membrane homing of the protein. In consistence, in-vivo studies in the mouse xenograft model showed that membrane expression of claudin-1 led to a significant increase of apoptotic cell death in the xenograft tumors that correlated with tumor growth inhibtion of about 60 % and an increased survival rate compared to untreated control groups. These results indicate that loss of claudin-1 expression and/or membrane localisation plays an important role for solid tumor progression.
Possible mechanisms for epigenetic gene silencing in tumor cells are methylation of promotor regions, altered activity of trancription factors and/or signaling cascades and abberant chromatin condensation. No evidence for claudin-1 promotor methylation in claudin-1 negative breast tumor cells could be detected. In addition, inhibition of MEK-1 did not affect claudin-1 expression and localization as well as the TJ diffusion barrier indicating that the Ras-MEK-ERK pathway does also not seem to be involved in regulation of claudin-1 in breast tumor cells. To evaluate the potential relevance of the retinoid receptor pathway and the chromatin structure for transcriptional claudin-1 repression in breast tumorigenesis, eight different breast tumor cell lines were treated with polygenetic response modifier compounds such as retinoids and HDAC inhibitors. It could be demonstrated that abberant retinoid receptor activation and chromatin condensation are involved in the regulation of claudin-1 in breast tumor cells. However, since different cell models showed heterogenous response to substance treatment and high expression levels of claudin-1 detected in normal breast epithelial cells cold not be reached, both regulatory pathways cannot alone be important for claudin-1 regulation. Loss of claudin-1 expression in breast cancer cells is more likely caused by multiple defects occuring in the tumorigenesis process of breast cancers and transcription, translation and membrane transport of claudin-1 may be controlled by different regulatory pathways.
In summary, this work provides evidence that loss of claudin-1 expression or altered homing pattern from the cell membrane to the cytosol is an advantage for their survival and growth of cancer cells in three dimensional growing tumors. Reconstitution of functional TJs might be a new concept in the cancer treatment in addition to inhibition of vascularization by inducing cell death through the blockage of survival biomolecule supply in solid tumors.
Metadata last modified: 04 Jun 2018 04:42
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