Polymalic acid (PMLA) is an interesting biopolymer, whose physiological activity is not yet fully understood. The progress in the enzymology of polymalate synthesis has been suffered from an inactivation of the synthetic activity during cell lysis. While the PMLA polymerase was not accessible, a malic acid-dependent ATP-PPi-exchange, which was presumed to belong to a partial activity of the ...
Abstract (English)
Polymalic acid (PMLA) is an interesting biopolymer, whose physiological activity is not yet fully understood. The progress in the enzymology of polymalate synthesis has been suffered from an inactivation of the synthetic activity during cell lysis. While the PMLA polymerase was not accessible, a malic acid-dependent ATP-PPi-exchange, which was presumed to belong to a partial activity of the polymerization enzyme, could be detected and followed to enrich a malic acid activase from plasmodial extracts. The exchange activity was only partially dependent on malic acid, while part of the activity was independent. A 45 kDa-protein has been isolated after ammonium sulfate precipitation and hydrophobic interaction chromatography and shown to form a protein~[32P]AMP conjugate from p45 and [alpha-32P]ATP. The conjugate was demonstrated by SDS-PAGE and autoradiography. The conjugate was consumed in the presence of malate, presumably by forming malyl~AMP, which could react with a second molecule L-malate in the active site of PMLA polymerase to form dimers and oligomers. Or it could dissociate from the activase and hydrolyze to form free malate and AMP. The unsubstituted ATP and alpha,beta-CH2-ATP but not beta,gamma-CH2-ATP strongly favored the formation of p45~AMP, suggesting that in addition phosphorylation activated molecules of p45 to form the conjugate. Subsequently it was shown that a protein was phosphorylated, which formed a complex with p45 under non-denaturing conditions. The products formed in the reaction mixture of p45 sample, ATP and L-malate were analyzed by reversed phase HPLC. Molecular species were detected that could resemble malic acid oligomers/PMLA. In the presence of the Tyr-kinase inhibitor Tyrphostin or after substitution of ATP by beta,gamma-CH2-ATP, the amounts of these synthesized species were enhanced. Alkaline hydrolysis of the products revealed a hydrolysis pattern that was reconcilable with that for alkaline hydrolysis of PMLA. The stimulation of p45~AMP formation by protein phosphorylation under conditions, which interfered with the synthesis of malic acid oligomers was interpreted by the assumption that the above mentioned phosphorylated protein rendered p45~AMP an abortive conjugate that was no longer on the pathway to malate oligomer formation. This mechanism could offer an explanation, why the PMLA polymerizing activity could not be detected in the extracts of plasmodia, assuming that the observed protein phosphorylation was part of a signal pathway triggered during cell rupture.
Translation of the abstract (German)
Polymalat (PMLA) ist ein interessantes Biopolymer, dessen physiologische Bedeutung noch nicht gut verstanden ist. Erschwert wird die Entschlüsselung der Polymalatsynthese durch den Verlust der Syntheseaktivität während des Zellaufschlusses. Während eine Polymalat-Polymerase also nicht direkt zugänglich war, konnte ein malatabhängiger ATP-PPi-Austausch, welcher Teil der Polymeraseaktivität sein ...
Translation of the abstract (German)
Polymalat (PMLA) ist ein interessantes Biopolymer, dessen physiologische Bedeutung noch nicht gut verstanden ist. Erschwert wird die Entschlüsselung der Polymalatsynthese durch den Verlust der Syntheseaktivität während des Zellaufschlusses. Während eine Polymalat-Polymerase also nicht direkt zugänglich war, konnte ein malatabhängiger ATP-PPi-Austausch, welcher Teil der Polymeraseaktivität sein sollte, gemessen werden. Weiter konnte eine solche Malataktivase aus Plasmodiumextrakten angereichert werden. Neben einer malat-abhängigen Phase des ATP-PPi-Austausches wurde auch eine malat-unabhängige und eine durch Malat gehemmte Phase gemessen. Nach einer Ammoniumsulfatpräzipitation und einer Hydrophoben Interaktionschromatographie konnte ein 45-kDa-Protein (p45) isoliert werden, das ein Protein~[32P]AMP-Konjugat mit [alpha-32P]ATP bildet. Der Konjugat konnte in einer SDS-Gelelektrophorese mit einer sich anschließenden Autoradiographie dargestellt werden. In Anwesenheit von Malat verschwand das Konjugat, mutmaßlich unter Bildung von Malyl~AMP und anschließender Reaktion mit weiteren L-Malat-Molekülen unter Bildung von Di- bzw. Oligomeren. Auch ist denkbar, dass zunächst gebildetes Malyl~AMP von der Aktivase dissoziiert und zu freier Apfelsäure und AMP hydrolysiert wird. Unsubstituiertes ATP und alpha,beta-CH2-ATP nicht aber beta,gamma-CH2-ATP begünstigte die Bildung von 45~AMP, was auf eine Aktivierung der p45-Molekülen durch Phosphorylierung schließen lässt. Es konnte nachfolgend tatsächlich gezeigt werden, dass ein Protein phosphoryliert wurde, welches unter nichtdenaturierenden Bedingungen ein Komplex mit p45 bildet. Die Produkte, die sich im Reaktionsansatz aus p45, ATP und L-Malat bildeten, wurden in einer Reversed-Phase-Chromatographie analysiert. Es konnten Moleküle detektiert werden, die sich wie Malat-Oligomere bzw. PMLA verhielten. In Anwesenheit des Tyr-Kinaseinhibitors Tyrphostin bzw. nach Substitution von ATP durch beta,gamma-CH2-ATP, konnte die Ausbeute wesentlich gesteigert werden. Nach alkalischer Hydrolyse dieser Produkte wurde ein Muster erhalten, das mit dem Muster einer alkalischen Hydrolyse von Oligomalat bzw. PMLA im Einklang steht. Die Störung der Oligomerbildung durch Proteinphosphorylierung kann dadurch erklärt werden, dass ein [32P]Tyr-Protein-Komplex gebildet wird, der nicht zur Bildung von Polymalat fähig ist. Ein solcher Mechanismus erklärt auch, warum die Polymalatsyntheseaktivität nicht in Plasmodienextrakten gemessen werden kann; die Proteinphosphorylierung könnte Teil eines Signaltransduktionsweges sein, der durch den Zellaufschluss initiiert wird.
Download Statistics