Mittels cDNA�Array-Technik (Atlas Human Cancer 1.2 Array, Clontech) wurde die Expression von 1176 krebsrelevanten Genen in verschieden stark fortgeschrittenen kolorektalen Karzinomen (zwei pT1-, vier pT2-, elf pT3-, acht pT4-Tumoren), normaler Darmschleimhaut derselben Patienten und 14 Lebermetastasen untersucht.
Zur Verifizierung der Array-Ergebnisse wurde die Expression von sieben Zielgenen ...
Abstract (German)
Mittels cDNA�Array-Technik (Atlas Human Cancer 1.2 Array, Clontech) wurde die Expression von 1176 krebsrelevanten Genen in verschieden stark fortgeschrittenen kolorektalen Karzinomen (zwei pT1-, vier pT2-, elf pT3-, acht pT4-Tumoren), normaler Darmschleimhaut derselben Patienten und 14 Lebermetastasen untersucht. Zur Verifizierung der Array-Ergebnisse wurde die Expression von sieben Zielgenen (CKS2, MYC, MIC1, BIGH3, IFITM, NGAL und UGT2B151) relativ zum stabil exprimierten Referenzgen TXBP151 am LightCycler quantifiziert und bestätigt. Mit Hilfe der Software Cluster und TreeView (Eisen et al., 1998) wurden Clusteranalysen durchgeführt.Es wurde eine getrennte Anordnung der neoplastischen (Tumoren / Metastasen) und normalen Geweben an den Hauptästen des Dendrogrammes beobachtet. Die neoplastischen Gewebe wurden weiterhin von der Software in zwei verschiedene Subgruppen unterteilt, die mit dem histologisch definierten Stadium korrelierten. Eine Subgruppe (high stage) enthielt zwei fortgeschrittene pT3- sowie alle pT4-Tumoren bzw. elf der 14 untersuchten Lebermetastasen. Dagegen umfaßte die andere Subgruppe (low stage) alle pT1-, pT2- und die meisten pT3-Tumoren (8/10; 80 %). Nur zwei pT3-Tumoren dieser Gruppe waren hämatogen metastasiert. Mit Hilfe statistischer Berechnungen wurden 60 Gene identifiziert (p < 0.001), die für die molekulare Klassifizierung der untersuchten kolorektalen Tumor- und Normalgewebe ausreichend waren und daher potentielle molekulardiagnostische Marker darstellen.
Im zweiten Teil dieser Arbeit sollten einzelne disseminierte Tumorzellen aus dem Knochenmark von Tumorpatienten isoliert und auf Einzelzell-Ebene charakterisiert werden. Anhand von spiking-Experimenten wurde eine Methode etabliert, mit der vitale, epitheliale Tumorzellen immunomagnetisch aus einer Überzahl normaler Blutzellen angereichert und unter mikroskopischer Kontrolle einzeln isoliert werden können. Im Knochenmark von 82 Patienten wurden nur in wenigen Fällen einzelne, morphologisch intakte, potentielle Tumorzellen detektiert. Bei ca. 30 % der Patienten wurden auffällige Zellen isoliert, die aber aufgrund von Zelldeformationen nicht vital erschienen. Obwohl zahlreiche Beobachtungen (Morphologie, klinischer Hintergrund) nahe legten, dass es sich bei diesen Zellen um Tumorzellen handelte, konnten in den Zellen keine tumorspezifischen Mutationen nachgewiesen werden. Die Voraussetzung für die molekulare Analyse der isolierten Zellen war die Etablierung von Methoden zur Extraktion von Nukleinsäuren aus geringen Zellzahlen. Standardmethoden wurden dabei so kombiniert und optimiert, dass schließlich eine simultane Isolierung von DNA und RNA zuverlässig aus einem Ausgangsmaterial von fünf Zellen durchgeführt werden konnte.
Translation of the abstract (English)
The expression of 1176 cancer-related genes was investigated by cDNA array technique in colorectal carcinomas (two pT1, four pT2, eleven pT3, eight pT4 tumors), corresponding normal mucosa and 14 liver metastases.
To confirm the results obtained by cDNA array, expression of seven genes (CKS2, MYC, MIC1, BIGH3, IFITM, NGAL und UGT2B151) was analyzed with the LightCycler relatively to the ...
Translation of the abstract (English)
The expression of 1176 cancer-related genes was investigated by cDNA array technique in colorectal carcinomas (two pT1, four pT2, eleven pT3, eight pT4 tumors), corresponding normal mucosa and 14 liver metastases. To confirm the results obtained by cDNA array, expression of seven genes (CKS2, MYC, MIC1, BIGH3, IFITM, NGAL und UGT2B151) was analyzed with the LightCycler relatively to the constantly expressed reference gene TXBP151. Cluster analysis was performed using software Cluster 2.02 and Treeview 1.45 (Eisen et al., 1998). Neoplastic tissues (tumors and metastases) and normal tissues were clearly separated into two main branches in the dendrogram. The tumor branch was further divided into two different subgroups reflecting the histological stage according to TNM classification: Two advanced pT3 tumors, all pT4 tumors and eleven of 14 metastases formed one closely related �high stage� subgroup. All pT1 tumors, all pT2 tumors and most pT3 tumors (8/10; 80 %) with three corresponding metastases formed one closely related �low stage� subgroup. Statistical analysis revealed 60 genes (p  0.001) which allowed this classification of colorectal carcinomas and normal tissues and may therefore represent important moleculardiagnostic markers.
The second part of this work was the isolation of individual disseminated tumor cells from bone marrow of tumor patients and the molecular characterization of these cells. By spiking experiments a method was established to differentiate vital epithelial tumor cells with immunomagnetic beads from a great number of normal blood cells. The tumor cells could be isolated under microscopic visualization. The bone marrow of 82 patients was then investigated but only individual cells were detected which potentially represented morphologically intact tumor cells. Out of 30 % of the patients cells were isolated but didn´t seem to be vital (according to cell deformation). Although morphology and clinical data suggested that these cells could be tumor cells, no tumor-specific mutations were detected. For the molecular analysis of these cells, methods were established to extract nucleic acids from a very low number of cells. According to the final protocol the simultanous isolation of DNA and RNA from five cells could be reproducibly performed.
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