| License: Publishing license for publications excluding print on demand (17MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-4457
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.10280
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 21 December 2005 |
| Referee: | Achim (Prof. Dr.) Göpferich |
| Date of exam: | 20 December 2004 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmaceutical Technology (Prof. Göpferich) |
| Keywords: | Knorpel , Tissue Engineering , Interleukin 4 , Insulin-like-Growth-Factor-Binding-Proteins , Extrazellulärmatrix , Langzeitkulturen , cartilage , tissue engineering , interleukin-4 , insulin-like growth factor binding proteins , extracellular matrix , long-term culture |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 10280 |
Abstract (English)
Tissue engineering (TE) of cartilage holds the promise to overcome the problems arising from the loss or failure of tissue. The optimization of the in vitro culture conditions is a very important step in the process of TE. The goal of this thesis was to study different factors affecting the development of in vitro engineered cartilage. Chondrocytes were seeded on biodegradable scaffolds. Then the ...
Abstract (English)
Tissue engineering (TE) of cartilage holds the promise to overcome the problems arising from the loss or failure of tissue. The optimization of the in vitro culture conditions is a very important step in the process of TE. The goal of this thesis was to study different factors affecting the development of in vitro engineered cartilage.
Chondrocytes were seeded on biodegradable scaffolds. Then the cell-polymer constructs were cultivated over 4 weeks to develop a cartilage-like tissue. After that, the cell-polymer construct was biochemically and histologically investigated. The effects of exogenously applied interleukin-4 (IL-4) and growth factor binding proteins (IGFBPs) on the development of the engineered cartilage were analyzed; investigations into the mechanism of action of IL-4 were conducted. Furthermore, the potential of new copolymer scaffolds to generate cartilage-like tissue was evaluated. An experiment was designed to monitor the development of in vitro engineered cartilage for 16 months with a special focus on a possible calcification of the engineered cartilage.
IL-4 was investigated in order to evaluate its potential to improve the quality of engineered cartilage. IL-4 was previously shown to inhibit degradation of GAG, a major component of cartilage ECM, though mechanisms of action are still controversially discussed. IL-4 had positive effects on ECM contents, and GAG distribution of the engineered cartilage. IL-4 increases the GAG content may be by inhibition of GAG degradation or increased GAG subtype synthesis. In order to elucidate the respective contributions, RT-PCR was employed to investigate the expression of (1) matrix metalloproteinases MMP-1, -3 and -13; (2) tissue inhibitor of metalloproteinases-1 (TIMP-1); and (3) aggrecan and biglycan. Our results suggest that IL-4 increases GAG fractions in engineered cartilage at least in part by decreasing MMP-13 expression.
IGFBPs are a family of six or more related proteins that affect the growth rate of cartilage, have a high affinity for IGF-I and modulate its actions. The hypothesis that IGFBP-4 inhibits the growth of cartilage in absence of IGF-I was evaluated in a well-established 3-D culture system. IGFBP-4 in the absence of exogenous IGF-I, had significant inhibitory effects on the growth rate and ECM of the engineered cartilage compared to control constructs in a dose-dependent manner. IGFBP-4 in the presence of IGF-I (50 ng/ml) had significant inhibitory effects at all molar ratios (1:0.5 - 1:100; IGF-I: IGFBP-4), as compared to constructs treated only with IGF-I. In contrast, compared to the control constructs, the combinations showed no inhibitory effects on the engineered constructs at low IGFBP-4 concentrations (1:3), demonstrating that IGF-I can overcome the inhibitory effects of IGFBP-4.The hypothesis that IGFBP-5 may function as a growth factor in cartilage, as for bone tissue, was evaluated. The effects of IGFBP-5 on in vitro engineered cartilage were investigated in the presence and absence of exogenous IGF-I. The results demonstrated that exogenous IGFBP-5 in absence of IGF-I clearly stimulated the growth of cartilaginous tissue constructs. The collagen per ww of the constructs was slightly increased. Histological cross-sections revealed a more coherent tissue formation after application of IGFBP-5, as compared to control constructs; GAG was more evenly distributed throughout the sections in IGFBP-5 constructs. In combinations with IGF-I, IGFBP-5 generally significantly reduced the effects of IGF-I at all molar ratios investigated.
Recently, a new copolymer scaffold has been developed consisting of hyaluronic acid, gelatin, and collagen. In order to improve mechanical stability of scaffolds made from natural polymers, chemical crosslinking (CL) can be employed. However, as chemical CL processes may lead to cell toxic effects or impairment of tissue development, such scaffolds have to be carefully investigated in cell culture. Scaffolds made from different derivatives of this copolymer, that is non-CL, genipin-, EDC- and glutaraldehyde-CL, were investigated. The results revealed that neither of the CL procedures impaired the development of cartilaginous tissues.Whereas CL using glutaraldehyde resulted in constructs which were very similar to constructs grown on non-CL scaffolds, CL by EDC as well as genipin even resulted in partial improvement of the grown constructs. The most advanced constructs were those grown on EDC-CL scaffolds.
The in vitro development of engineered cartilage was monitored over 16 months. The engineered tissues grew continuously over one year and contained high amounts of ECM. Insulin-receiving constructs were dramatically larger in size and had larger ECM contents. After 16 months, scattered zones of calcification developed in the engineered cartilage. It appears important to evaluate, in future studies, the long-term performance of tissue engineered cartilage in vivo.
Translation of the abstract (German)
Das Tissue Engineering (TE) von Knorpel ist ein vielversprechender Ansatz, die durch Schädigung oder Verlust eines Gewebes entstehenden Probleme zu lösen. Die Optimierung der In-vitro-Kulturbedingungen stellt einen wichtigen Schritt im TE dar. Das Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung von verschiedenen Faktoren, die die Entwicklung von in vitro gebildetem Knorpel beeinflussen. Knorpelzellen ...
Translation of the abstract (German)
Das Tissue Engineering (TE) von Knorpel ist ein vielversprechender Ansatz, die durch Schädigung oder Verlust eines Gewebes entstehenden Probleme zu lösen. Die Optimierung der In-vitro-Kulturbedingungen stellt einen wichtigen Schritt im TE dar. Das Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung von verschiedenen Faktoren, die die Entwicklung von in vitro gebildetem Knorpel beeinflussen.
Knorpelzellen wurden auf bioabbaubare Scaffolds ausgesät. Diese Zell-Polymer-Konstrukte wurden über 4 Wochen kultiviert, um ein Knorpelgewebe (KG) zu erhalten. Anschließend wurden die KG biochemisch und histologisch untersucht. Der Effekt von Interleukin-4 (IL-4) und Insulin-like Growth Factor Binding Proteinen (IGFBPs) auf die Wachstumsrate und den Gehalt an Bestandteilen der Extrazellulärmatrix (ECM) des gebildeten Knorpels wurde analysiert; Untersuchungen zum Wirkmechanismus von IL-4 wurden durchgeführt. Weiterhin wurde das Potential von neuen Copolymer-Scaffolds für die Generierung von KG bestimmt. Weiterhin wurde die Entwicklung von in vitro gebildetem Knorpel über 16 Monate verfolgt, wobei ein spezielles Augenmerk auf möglicher Kalzifizierung des sich bildenden Knorpels lag.
IL-4 wurde untersucht um sein Potential zur Verbesserung der Qualität des TE- Knorpels zu bestimmen. In früheren Arbeiten zeigte sich, dass IL-4 den Abbau von Glykosaminoglykanen (GAG) hemmt, allerdings wird der Mechanismus noch kontrovers diskutiert. IL-4 hatte einen positiven Effekt auf die Wachstumsrate, die ECM-Zusammensetzung und die GAG-Verteilung des gebildeten Knorpels. Der höhere GAG-Gehalt könnte durch die Hemmung des Abbaus oder durch vermehrte Synthese von GAG-Subtypen hervorgerufen werden. Es wurde RT-PCR durchgeführt, um die entsprechenden möglichen Beiträge zu untersuchen von (1) Matrixmetalloproteinasen MMP-1, -3 und �13, und (2) von Tissue Inhibitor of Metalloproteinases-1 (TIMP-1), sowie (3) Aggrecan und Biglycan. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass IL-4 den GAG-Anteil, zumindest teilweise, durch verminderte MMP-13- Expression erhöht.
Die Familie der IGFBPs besteht aus mindestens 6 verwandten Proteinen, die die Wachstumsrate von Knorpel beeinflussen sowie eine hohe Affinität zu IGF-I zeigen und dessen Aktivität beeinflussen können. Die Hypothese, IGFBP-4 hemme das Wachstum von KG in Abwesenheit von IGF-I, konnte in der etablierten 3D Zellkultur bestätigt werden (Kapitel 4). In Abwesenheit von IGF-I hatte IGFBP-4 einen signifikant hemmenden, dosisabhängigen Einfluss auf die Wachstumsrate der ECM, bezogen auf die Kontrolle. In Kombinationen mit IGF-I (1:0,5 - 1:100) wurde bei niedrigen IGFBP-4-Konzentrationen (1:3) kein inhibitorischer Effekt auf die Entwicklung der ECM nachgewiesen. Dies bestätigt, dass IGF-I die inhibitorischen Effekte des IGFBP-4 kompensieren kann.
Die Hypothese untersucht, dass IGFBP-5 ebenso für in vitro gezüchtetes KG als Wachstumsfaktor dienen könnte, wie es bereits für KG beschrieben wurde. Die Ergebnisse zeigten, dass IGFBP-5 in Abwesenheit von IGF-I das Wachstum von Knorpelgewebekonstrukten deutlich stimulierte. Der Kollagengehalt bezogen auf das Nassgewicht war dabei leicht erhöht. GAG war bei den mit IGFBP-5 behandelten Konstrukten über den gesamten Querschnitt gleichmäßiger verteilt. In Kombinationen mit IGF-I wurden bei allen untersuchten molaren Verhältnissen die durch IGF-I hervorgerufenen Effekte durch IGFBP-5 signifikant abgeschwächt.
Kürzlich wurde ein neuartiges Scaffold, bestehend aus einem Copolymer aus Hyaluronsäure, Gelatine und Kollagen, entwickelt. Um die mechanische Stabilität von solchen aus natürlichen Polymeren bestehenden Scaffolds zu verbessern kann eine chemische Quervernetzung durchgeführt werden. Da jedoch eine derartige Quervernetzung zelltoxische Effekte hervorrufen bzw. die Gewebebildung beeinträchtigen kann, müssen die Scaffolds in Zellkultursystemen sorgfältig untersucht werden. die Untersuchung derartiger Scaffolds, d.h. nicht quervernetzte Scaffolds und Scaffolds, die entweder mit Genipin, EDC oder Glutaraldehyd quervernetzt wurden. Wie die Resultate zeigen konnten, wurde die Knorpelgewebebildung von keiner der angewendeten Quervernetzungsprozeduren negativ beeinflusst. Im Allgemeinen kann gesagt werden, dass die mit Glutaraldehyd behandelten zu sehr ähnlichen Ergebnissen führten wie die unbehandelten Scaffolds. Quervernetzung sowohl mit EDC als auch mit Genipin führte sogar zu einer teilweisen Verbesserung des gebildeten Gewebes.
Die Entwicklung von gezüchtetem KG über einen Zeitraum von 16 Monaten beobachtet. nahm das sich bildende Gewebe kontinuierlich über einen Zeitraum von einem Jahr an Größe zu und enthielt große Mengen an ECM. Konstrukte, die über diesen Zeitraum zusätzlich Insulin erhielten, waren deutlich größer und enthielten einen noch höheren. Die Konstrukte zeigten nach 16 Monaten vereinzelte kalzifizierte Zonen im entstandenen KG. Es erscheint daher sinnvoll, das Langzeitverhalten von in vitro gebildetem KG in weiteren Studien in vivo zu untersuchen.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 13:23
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