Abstract (German)
In dieser Arbeit wurde untersucht, ob MIA, neben Wechselwirkungen mit Extrazellularmatrixmolekülen, auch spezifisch mit Rezeptoren auf der Oberfläche von Melanomzellen interagieren kann. Zusätzlich sollte geklärt werden, um welche Rezeptoren es sich dabei handelt. Zur Verbesserung der Detektion von MIA wurde dieses biotinyliert. Die Herstellung des rekombinanten, biotinmarkierten Moleküls ...
Abstract (German)
In dieser Arbeit wurde untersucht, ob MIA, neben Wechselwirkungen mit Extrazellularmatrixmolekülen, auch spezifisch mit Rezeptoren auf der Oberfläche von Melanomzellen interagieren kann. Zusätzlich sollte geklärt werden, um welche Rezeptoren es sich dabei handelt. Zur Verbesserung der Detektion von MIA wurde dieses biotinyliert. Die Herstellung des rekombinanten, biotinmarkierten Moleküls erfolgte in einem zellfreien, in vitro Transkriptions-/Translationssystem auf E.coli Basis (RTS Roche). Das daraus gewonnene, biotinmarkierte Protein wurde für die gesamten Experimente verwendet. Die korrekte Faltung des Proteins konnte dadurch verifiziert werden, dass es möglich war, das biotinylierte MIA mittels Antikörper in einem bereits etablierten ELISA-Assay nachzuweisen. Durch zusätzliche funktionelle Assays, wie Zellmigrationsassay und Invasionsassay, konnte ebenfalls sichergestellt werden, dass die migrationshemmende Wirkung von MIA auf Zellen in vitro, auch nach dessen Biotinmarkierung, erhalten blieb.
In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass MIA die Aktivität der MAP-Kinase ERK 1/2 vermindert. Zusätzlich konnte erstmals gezeigt werden, dass MIA nicht nur an Extrazellularmatrixproteine, sondern direkt spezifisch an die Fibronektinrezeptoren alpha4 beta1 und alpha5 beta1 binden kann. Weitere Untersuchungen zur Wirkungsweise von MIA auf Integrine ergaben, dass MIA die Aktivierung der Integrine hemmen kann.
Im Rahmen eines weiteren Projekts stellte sich bei einer Untersuchung von Zell-Zelldadhäsionsproteinen mittels Western Blot heraus, dass das klassische P-Cadherin in Melanomzellen in einer verkürzten, 50 kDa Form vorliegt. Dabei wurde gezeigt, dass die Verkürzung von P-Cadherin bereits auf mRNA-Ebene nachgewiesen werden kann. Mittels RT-PCR konnte demonstriert werden, dass in allen untersuchten Melanomzelllinien das 3´Ende der mRNA von P-Cadherin ab Exon 10 fehlte.
Mit einer 3´RACE PCR und einem Datenbankscreening, welches spezifisch für Spleißprodukte war, wurde ausgeschlossen, dass es sich bei der Verkürzung um alternatives Spleißen der mRNA handelte. Die Daten ließen auch den Rückschluss zu, dass es sich nicht um posttranslationale Prozessierung des Proteins handeln konnte. Publikationen über diverse fragile Stellen an der P-Cadherin Chromosomenstelle 16q22.1 führten zur Vermutung, dass die Verkürzung von P-Cadherin von einer Translokation an dieser Stelle im Chromosom herrühren muss. In weiteren Versuchen konnte zudem dargestellt werden, dass die verkürzte Form von P-Cadherin in Melanomzellen, im Gegensatz zur Wildtypisoform, nicht in der Membran der Zellen verankert ist, sondern in die extrazelluläre Matrix sezerniert wird. Mittels eines tissue microarrays konnte der membranständige und zytoplasmatische Verlust von P-Cadherin mit zunehmender Tumordicke und zunehmendem Clark Level bestätigt werden.
MIA wurde in vorliegender Arbeit eine aktive Rolle in der spezifischen Hemmung der Integrine alpha4 beta1 und alpha5 beta1 zugewiesen. Das in Melanomzellen trunkierte und sezernierte P-Cadherin kann durch homophile Interaktion mit membranständigem Vollänge-P-Cadherin benachbarter Zellen die Ausbildung normaler Zell-Zell-Kontakte möglicherweise verhindern. Dadurch ist es entarteten Zellen potentiell möglich, sich leichter aus dem organisierten Gefüge des Gewebes zu lösen.
Zusammenfassend konnte in dieser Dissertation gezeigt werden, welchen Beitrag die Proteine MIA und P-Cadherin möglicherweise bei der Auswanderung von Tumorzellen aus dem Zellverband leisten können.
Translation of the abstract (English)
In this work it was examined whether MIA, besides association to extracellular molecules, could specifically interact with receptors on the surface of melanoma cells.Additionally it was examined which receptors are involved in this. To improve detection of MIA it was biotinylated. The recombinant, biotinylated protein was produced on the basis of the rapid transcription/translation system (RTS ...
Translation of the abstract (English)
In this work it was examined whether MIA, besides association to extracellular molecules, could specifically interact with receptors on the surface of melanoma cells.Additionally it was examined which receptors are involved in this. To improve detection of MIA it was biotinylated. The recombinant, biotinylated protein was produced on the basis of the rapid transcription/translation system (RTS Roche). The resulting biotinylated protein was used for all experiments. The correct folding of the protein could be verified in an existing ELISA and functional cell migration and invasion assays prooved the migration blocking effect of MIA on cells in vitro. In this work it was shown that MIA reduces the activity of the MAP kinase EKR 1/2. Additionally it could be shown for the first time that MIA directly binds to the fibronectin receptors alpha4 beta1 and alpha5 beta1. And it was proven that MIA could inhibit the activation of integrins.
In a further project it was shown that the classical P-Cadherin had a shortened form of 50 kDa in melanoma cells. The truncation of P-Cadherin could be demonstrated on mRNA level. Via RT-PCR it could be shown that the 3´end of P-Cadherin was missing from exon 10 on. Via 3´RACE PCR and a database screening which was specific for splice variants, it was shown that there is no alternative splicing of the mRNA involved. The data also excluded the possibility of a post translational processing of the protein. Publications about fragile sites at the P-Cadherin Chromosome position 16q22.1 led to the conclusion that the truncation comes from a translocation at this chromosome site. Further it was shown that the shortened form of P-Cadherin does not occur in the membrane but is secreted. Via tissue microarray it was demonstrated that the loss of P-Cadherin in the membrane correlated with increasing tumor thickness and Clark Level.
To summarize this work it could be shown MIA and P-Cad that both proteins can possibly make melanoma cells migrate and brake out of their normal cell surrounding.
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