Untersuchungen zur Wahrnehmung und Aufnahme von Riboflavin in Saccharomyces cerevisiae

Item type:	Thesis of the University of Regensburg (PhD)
Open Access Type:	Primary Publication
Date:	5 November 2006
Referee:	Jürgen (PD Dr.) Stolz
Date of exam:	23 August 2006
Institutions:	Biology, Preclinical Medicine > Institut für Pflanzenwissenschaften > Lehrstuhl für Zellbiologie und Pflanzenphysiologie (Prof. Dr. Klaus Grasser)
Keywords:	Vitamin B2 , Aufnahme , Wahrnehmung , Saccharomyces cerevisiae , Schizosaccharomyces pombe , Carrier-Proteine , Genexpression , Transport , Riboflavin , Uptake , Sensing , Saccharomyces cerevisiae , Schizosaccharomyces pombe , transport
Dewey Decimal Classification:	500 Science > 570 Life sciences
Status:	Published
Refereed:	Yes, this version has been refereed
Created at the University of Regensburg:	Yes
Item ID:	10475

Abstract (German)

Riboflavin ist ein wasserlösliches Vitamin der B-Gruppe und wird für die Biosynthese der Cofaktoren FMN und FAD benötigt. Höhere Eukaryonten (mit Ausnahme von Pflanzen)können Riboflavin nicht selbst synthetisieren und müssen es somit durch Transportproteine aus der Nahrung aufnehmen. Es konnte für einige Eukaryonten bereits Riboflavinaufnahme gezeigt werden, jedoch war bislang von keinem ...

Abstract (German)

Riboflavin ist ein wasserlösliches Vitamin der B-Gruppe und wird für die Biosynthese der Cofaktoren FMN und FAD benötigt. Höhere Eukaryonten (mit Ausnahme von Pflanzen)können Riboflavin nicht selbst synthetisieren und müssen es somit durch Transportproteine aus der Nahrung aufnehmen. Es konnte für einige Eukaryonten bereits Riboflavinaufnahme gezeigt werden, jedoch war bislang von keinem Transportprotein die Sequenz bekannt. In der vorliegenden Doktorarbeit wurde ein genetischer Ansatz, bei dem Zellen mit einem deletierten Riboflavinbiosynthesegen (ribΔ-Mutanten) mit einer Multicopy-Genbank komplementiert wurden, zur Ermittlung eines Riboflavintransporters verwendet. Dies führte zur Identifizierung von MCH5 aus S. cerevisiae, welches Homologien zu menschlichen Monocarboxylattransportproteinen besitzt und den Plasmamembrantransporter für Riboflavin kodiert. Zunächst konnte durch Wachstumstests in ribΔ-Mutanten nachgewiesen werden, dass eine Überexpression bzw. Deletion von MCH5 den Riboflavinbedarf der untersuchten Zellen
deutlich verändert hat. Anschließend konnte sowohl in MCH5-überexprimierenden
S. cerevisiae rib4Δ-Zellen als auch in MCH5 heterolog exprimierenden S. pombe-Zellen gezeigt werden, dass es sich bei Mch5p um einen hochaffinen Transporter (Km = 17 ± 6 μM) mit einem pH-Optimum von 7,5 handelt. Der Transportvorgang wird durch Protonophoren nicht inhibiert und durch Zugabe von Glucose oder Ethanol nicht stimuliert. Dies deutet darauf hin, dass Mch5p ein Uniporter ist. Die verbliebenen Proteine der Mchp-Familiescheinen nicht am Transport von Riboflavin beteiligt zu sein.
Die Expression von MCH5 wird in einer rib5Δ-Mutante mit abnehmender Riboflavinkonzentration gesteigert. Die untersuchten Zellen sind in der Lage Riboflavinkonzentrationen wahrzunehmen sowie einem Mangel durch eine höhere Expression von MCH5 entgegenzuwirken.Die Analyse von Fragmenten des MCH5-Promotors ergab, dass die riboflavinabhängige Expression im Bereich -531 bp bis -398 bp des Promotors stattfindet. In diesem Bereich liegt eine Bindestelle für Put3p, an welcher die riboflavinabhängige Expression von MCH5 durch den Transkriptionsfaktor Put3p erfolgt. Put3p induziert in Anwesenheit von
Prolin die Transkription der Gene zur Degradation von Prolin zu Glutamat und MCH5. Bei den Proteinen, die für die Verwertung von Prolin als Stickstoffquelle benötigt werden, handelt es sich um die Prolinoxidase Put1p und die P5C-Dehydrogenase Put2p. Put1p trägt in seiner aktiven Form FAD- das aus Riboflavin synthetisiert wird- als Cofaktor. Diese Fakten führten
zur Erstellung eines Modells zur Wahrnehmung von Riboflavin. In diesem Modell führt die Anhäufung von Prolin, durch eine geringere Aktivität von Put1p, zur Transkriptionsaktivierung durch Put3p und dadurch zur Expression von MCH5.

Translation of the abstract (English)

Riboflavin is a water-soluble vitamin (vitamin B2) required for the production of the flavin cofactors FMN and FAD. Mammals are unable to synthesize riboflavin and need a dietary supply of the vitamin. For some eukaryotes it was shown, that they transport riboflavin across the plasma membrane but their sequences remained elusive. In this studies a genetic approach was used to isolate MCH5, a ...

Translation of the abstract (English)

Riboflavin is a water-soluble vitamin (vitamin B2) required for the production of the flavin cofactors FMN and FAD. Mammals are unable to synthesize riboflavin and need a dietary supply of the vitamin. For some eukaryotes it was shown, that they transport riboflavin across the plasma membrane but their sequences remained elusive. In this studies a genetic approach was used to isolate MCH5, a Saccharomyces cerevisiae gene with homology to mammalian monocarboxylate transporters, and characterize the protein as a plasma membrane transporter for riboflavin. This conclusion is based on the suppression of riboflavin biosynthetic mutants (rib mutants) by overexpression of MCH5 and by synthetic growth defects caused by deletion of MCH5 in rib mutants. Transport experiments in S. cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe cells demonstrate that Mch5p is a high affinity transporter (Km = 17 µM) with a pH optimum at pH 7.5. Riboflavin uptake is not inhibited by protonophores, does not require metabolic energy, and operates by a facilitated diffusion mechanism. Moreover, the other members of the MCH gene family appear to have unrelated functions.
The expression of MCH5 is regulated by the intracellular riboflavin content. This indicates that S. cerevisiae has a mechanism to sense riboflavin and avert riboflavin deficiency by increasing the expression of the plasma membrane transporter MCH5. Analysis of the MCH5 promotor showed, that the riboflavin depending expression of MCH5 is induced by the transcriptional factor Put3p. It also activates the expression of the prolin degradation genes Put1p and Put2p. The active form of Put1p carries the cofactor FAD (derived from riboflavin). These facts led to a model for riboflavin sensing. In this model the accumulation of proline, caused by reduced activity of Put1p, leads to induction of the transcription by Put3p and therefore to the expression of MCH5.

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