| License: Publishing license for publications excluding print on demand (6MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-7450
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.10525
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 16 December 2007 |
| Referee: | Thomas (Prof. Dr.) Dobner |
| Date of exam: | 20 September 2006 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine |
| Keywords: | Adenovirus 5 , Replikation , Protein p53 , SUMO , Regulation , Messenger-RNS , Membrantransport , Ubiquitin-ähnliche Proteine , NES , RNA-Export , E1B-55K , E4orf6 , Mre11 , E1B-55K , E4orf6 , NES , SUMO , RNA-export |
| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 10525 |
Abstract (German)
Das E1B-55K-Protein von Adenovirus Typ 5 ist ein multifunktionelles Phosphoprotein, das eine zentrale Rolle im produktiven Replikationszyklus von Ad5 einnimmt. Die lytischen Aktivitäten des E1B-Proteins werden zumindest teilweise im Komplex mit dem viralen Protein E4orf6 vermittelt. Soweit bekannt fördert der E1B-55K/E4orf6-Komplex (E1B/E4-Komplex) den nukleozytoplasmatischen Transport viraler ...
Abstract (German)
Das E1B-55K-Protein von Adenovirus Typ 5 ist ein multifunktionelles Phosphoprotein, das eine zentrale Rolle im produktiven Replikationszyklus von Ad5 einnimmt. Die lytischen Aktivitäten des E1B-Proteins werden zumindest teilweise im Komplex mit dem viralen Protein E4orf6 vermittelt. Soweit bekannt fördert der E1B-55K/E4orf6-Komplex (E1B/E4-Komplex) den nukleozytoplasmatischen Transport viraler mRNAs und fördert somit die Synthese viraler Kapsidproteine bzw. die Produktion von Nachkommenviren. Darüber hinaus werden dem E1B/E4-Komplex auch posttranslationale Funktionen beim proteasomalen Abbau des zellulären Tumorsuppressorproteins p53 und dem zellulären DNA-Reparaturkomplex MRN (Mre11, Rad50, NBS1) zugeordnet. Es gibt erste Hinweise, dass beide Aktivitäten mit einer nukleozytoplasmatischen Pendelfunktion in Verbindung stehen, die über ein CRM1-abhängiges Leucin-reiches Kernexportsignal (NES) in beiden viralen Proteinen und ein zum E1B-NES eng benachbartes SUMO1-Konjugationsmotiv (SKM) reguliert wird.
Die vorliegende Arbeit befasste sich mit Untersuchungen zur Funktion der E1B-55K- und E4orf6-Proteine in der Regulation des produktiven Replikationszyklus von Ad5, und insbesondere mit Fragestellungen zur Regulation des viralen mRNA-Transports durch den E1B/E4-Komplex. Dazu wurden im ersten Schritt, mit Hilfe eines direkten Klonierungsverfahrens, Mutationen in die kodierenden Bereiche der E1B- und/oder E4orf6-Gene im Ad5-Genom eingeführt, die zu Aminosäureaustauschen in: (1) den NESs von E1B-55K und/oder E4orf6, (2) im SKM von E1B-55K und (3) in den p53- bzw. MRN-Interaktionsdomänen von E1B-55K führen. Anschließend wurde der Einfluss der Mutationen auf die virale Replikation überprüft. Insgesamt bestätigen diese Versuche die Annahme, dass E1B-55K und vermutlich der E1B-55K/E4orf6-Komplex in lytisch infizierten Zellen kontinuierlich über den Exportrezeptor CRM1 aus dem Zellkern transportiert wird. Im Unterschied zu E4orf6 führen Mutationen im E1B-NES zu einer fast vollständigen Restriktion des viralen Proteins im Zellkern, wo das virale Protein an der Peripherie der sog. viralen Replikationszentren akkumuliert. Interessanterweise wird die nukleäre Restriktion und Lokalisation an den viralen Replikationszentren durch die gleichzeitige Mutation des SKM vollständig aufgehoben. Diese Beobachtungen zeigen erstmals, dass E1B-55K posttranslational durch SUMOylierung an die Orte der viralen DNA-Synthese, Transkription und RNA-Prozessierung dirigiert wird und lassen zudem vermuten, dass die Konjugation mit SUMO1 einen CRM1-unabhängigen Exportweg des viralen Proteins reguliert.
Trotz der deutlich veränderten Lokalisation des E1B-55K-Proteins haben Mutationen im E4orf6- und/oder E1B-NES sowie im E1B-SKM keinen negativen Einfluss auf die zytoplasmatische Akkumulation viraler Transkripte, Synthese später Strukturproteine, Produktion von Nachkommenviren und den proteasomalen Abbau von MRN. Dieser Befund ist überraschend und widerspricht vollständig der momentan vorherrschenden Modellvorstellung. Obwohl die molekulare Grundlage dieser Ergebnisse noch unklar ist, zeigen die Untersuchungen dieser Arbeit, dass der nukleäre Export von E1B-55K und E4orf6 auch über die CRM1-unabhängigen RNA-Exportrezeptoren HuR und/oder TAP/NXF1 gesteuert wird, da sowohl die HuR-Liganden pp32 und APRIL als auch das TAP/NXF1-Adaptorprotein Aly/REF1 an den E1B/E4-Komplex binden. Während pp32 bekanntermaßen über E4orf6 mit dem E1B/E4-Komplex wechselwirkt, zeigen Koimmunpräzipitationsversuche erstmalig, dass APRIL und Aly/REF1 über E1B-55K mit dem viralen Proteinkomplex interagieren. Eine direkte Beteiligung von Aly/REF1 am RNA-Exportvorgang wird durch Immunfluoreszenzanalysen unterstützt, die zeigen, dass das RNA-bindende hnRN-Protein an die Peripherie der viralen Replikationszentren rekrutiert wird. Außerdem wurden Hinweise erhalten, dass sowohl p53 als auch MRN an diesen Vorgängen direkt oder indirekt beteiligt sind, da der Verlust des proteasomalen Abbaus dieser zellulären Faktoren über den E1B/E4-Komplex mit einer Reduktion später viraler mRNAs und einer stark verringerten Synthese später viraler Proteine sowie Produktion von Nachkommenviren korreliert.
Weiterhin wurden im Verlauf dieser Arbeit erstmals zwei neue Isoformen des E1B-55K-Proteins (E1B-48K und E1B-49K) identifiziert. Nach einem vorläufigen Modell werden diese aminoterminal verkürzten E1B-Proteine aufgrund einer sog. internal ribosomal entry site (IRES) und/oder durch den Vorgang des leaky scanning während der Translation der E1B-55K-mRNA gebildet. Die Phänotypisierung einer E1B-55K-negativen Virusmutante, die nur E1B-48K und E1B-49K bildet, zeigt, dass die Expression beider Isoformen für die effiziente virale Replikation ausreichen.
Translation of the abstract (English)
The human subgroup C adenovirus type 5 (Ad5) E1B-55K protein is a multifunctional regulator of Ad5 replication participating in many processes required for efficient virus production. A complex containing the E1B-55K and the adenoviral E4orf6 protein (E1B/E4-complex) has been implicated in the proteolytic degradation of the tumor suppressor protein p53 and Mre11, a key component of the mammalian ...
Translation of the abstract (English)
The human subgroup C adenovirus type 5 (Ad5) E1B-55K protein is a multifunctional regulator of Ad5 replication participating in many processes required for efficient virus production. A complex containing the E1B-55K and the adenoviral E4orf6 protein (E1B/E4-complex) has been implicated in the proteolytic degradation of the tumor suppressor protein p53 and Mre11, a key component of the mammalian DNA double-strand break repair Mre11/Rad50/Nbs1 (MRN) complex, shut-off of host cell protein synthesis and selective viral late mRNA transport from the nucleus to the cytoplasm. It has been suggested that these multiple activities involve continuous nucleocytoplasmic shuttling mediated through a leucine-rich nuclear export signal (NES) present in both Ad5 proteins, conjugation of the small ubiquitin-related modifier protein 1 (SUMO1) in close proximity to the E1B-NES and interactions with a variety of key regulators of cell growth.
To investigate the role of the E1B/E4-complex in Ad5 replication we generated virus mutants carrying amino acid exchanges (1) in the NES of E1B-55K, E4orf6 and both proteins, (2) in the SUMO1 conjugation site (SCS) of E1B-55K and (3) in the p53- and MRN-interacting domain of E1B-55K. These studies confirm that E1B-55K and presumably the E1B/E4-complex is exported to the cytoplasm via the export receptor CRM1 in infected cells. As opposed to the E4orf6 NES functional inactivation of the corresponding motif in E1B-55K causes an almost complete redistribution of the viral protein from the cytoplasm to the nucleus and its accumulation at the periphery of the viral replication centers. Interestingly, however, this nuclear restriction imposed upon the NES mutant protein is fully compensated by concurrent inactivation of the adjacent SCS. These findings indicate that SUMOylation plays a role in the targeting of E1B-55K to the viral transcription and replication centers and implicate that SUMO1 conjugation and deconjugation regulates nuclear export of the Ad protein through a CRM1-independent pathway. Despite the altered localization of the E1B proteins mutations in the E4orf6- and/or the E1B-NES as well as the E1B-SCS have no or only moderate effects on viral DNA synthesis, cytoplasmic accumulation of viral late mRNA transcripts, late viral protein expression, virus growth and proteasomal degradation of the MRN complex. Although the molecular basis of these findings is still unclear, our data indicate that E1B-55K and E4orf6 can exit the nucleus with cellular export receptors different from CRM1. These may correspond to HuR and/or TAP/NXF1 since both the HuR ligands pp32 and APRIL and the TAP/NXF1 adapter protein Aly/REF1 can bind to the E1B/E4-complex. Further support for this model comes from the finding that the hnRNP-like protein Aly/REF1 is recruited to the periphery of the viral replication centers in infected cells. Also, it seems likely that both p53 and MRN subunits directly or indirectly participate in viral mRNA export since expression of viral late proteins and virus growth is substantially reduced in the absence of their proteasomal degradation.
Finally, results from these studies demonstrate the existence of two isoforms (E1B-48K and E1B-49K) of the E1B-55K protein. Both N-terminal truncated forms are possibly synthesized via an internal ribosome entry site (IRES) or leaky scanning during the translation of the E1B-55K-mRNA. Phenotypic analyses of an E1B-55K deficient virus mutant, which only synthesizes E1B-48K and E1B-49K show that the expression of the two isoforms is sufficient for maximal virus production.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 12:50
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