| License: Publishing license for publications excluding print on demand (5MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-7716
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.10551
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 22 May 2007 |
| Referee: | Susanne (Prof. Dr.) Modrow |
| Date of exam: | 28 February 2007 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene Biology, Preclinical Medicine |
| Keywords: | Entwicklungsbiologie , Zelldifferenzierung , Maus , Leber , In vitro , Markierungsgen , Embryonale Stammzelle , Leberepithelzelle , Organogenese , Embryonale Stammzellen , Hepatozyten , transgene Zelllinien , cell differentiation , in vitro , mouse , hepatocytes , reporter cell lines |
| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 10551 |
Abstract (German)
Die Entwicklung der Organe höherer Lebewesen ist ein komplexer Vorgang, bei dem es zu zahlreichen Wechselwirkungen zwischen Zellen aus unterschiedlichen Geweben kommt. Die Isolierung embryonaler Stammzellen (ES-Zellen) und die Entdeckung, dass diese auch in vitro zu verschiedenen reifen somatischen Zelltypen differenzieren können, bietet ein neues System, um einen Einblick in die Entstehung ...
Abstract (German)
Die Entwicklung der Organe höherer Lebewesen ist ein komplexer Vorgang, bei dem es zu zahlreichen Wechselwirkungen zwischen Zellen aus unterschiedlichen Geweben kommt. Die Isolierung embryonaler Stammzellen (ES-Zellen) und die Entdeckung, dass diese auch in vitro zu verschiedenen reifen somatischen Zelltypen differenzieren können, bietet ein neues System, um einen Einblick in die Entstehung unterschiedlicher Zelltypen während der Entwicklung der Säugetiere zu erhalten.
Die Veröffentlichung mehrerer Protokolle, die eine Generierung hepatozytenähnlicher Zellen aus murinen ES-Zellen in vitro beschreiben, eröffnet nun die Möglichkeit, auch die Organogenese der Leber in diesem System genauer zu studieren. Neben der Untersuchung des Einflusses externer Faktoren auf den Differenzierungsprozess könnte die Durchführung differentieller Genexpressionsanalysen neue Gene identifizieren, die für die Entwicklung der Hepatozyten relevant sind. Voraussetzung hierfür sind neben effizienten Differenzierungsprotokollen Methoden, die eine unkomplizierte Analyse des Differenzierungsvorgangs ermöglichen. Zudem bedarf es Verfahren, die eine Isolierung erfolgreich differenzierter Zellen zu unterschiedlichen Zeitpunkten des Differenzierungsprozesses gestatten. Ziel der Arbeit war es zunächst ein optimiertes Differenzierungsprotokoll zu etablieren und ein Reportersystem zur Analyse des Differenzierungsvorgangs zu generieren.
Im Zuge dieser Arbeit wurde deshalb ein Differenzierungsprotokoll etabliert, das auf dem im Jahr 2001 von Takashi Hamazaki et al. publizierten Protokoll beruht und auf der Generierung dreidimensionaler Aggregate, so genannten embryoid bodies (EBs), und anschließender Stimulierung durch externe Faktoren beruht. Im Zuge der Optimierung des Protokolls konnte durch eine Anpassung des Zeitpunktes der Zugabe der einzelnen Faktoren an das spezifische Differenzierungsverhalten der verwendeten Zelllinie eine gesteigerte Expression hepatozytenspezifischer Markergene erzielt werden. Zudem wurde versucht, neue Erkenntnisse über die in vitro-Differenzierung embryonaler Stammzellen zu Hepatozyten im Differenzierungsprotokoll zu berücksichtigen. Der von einer anderen Gruppe beschriebene positive Einfluss eines zeitlich begrenzten Serumentzugs auf die Entstehung von Hepatozyten-Vorläufern während der Differenzierung in EBs konnte dabei nicht bestätigt werden. Auch fibroblast growth factor-4, der in einem auf der Differenzierung in Monolayer-Kultur basierenden Protokoll zu einer vermehrten Entstehung hepatozytenähnlicher Zellen führt, zeigte im hier verwendeten System nicht den erhofften Effekt.
Durch den Einsatz unterschiedlicher Serumpräparationen zeigt die Arbeit jedoch, dass nicht nur die An- oder Abwesenheit von im Serum enthaltenen Faktoren einen entscheidenden Einfluss auf den Differenzierungsprozesses hat, sondern bereits geringe Unterschiede in deren Zusammensetzung und Konzentration, wie sie bei verschiedenen Chargen vorliegen, die Differenzierung der Zellen deutlich beeinflusst. Dies verdeutlicht die Probleme bei der Vergleichbarkeit der Ergebnisse unterschiedlicher Arbeitsgruppen und somit die Notwendigkeit definierter Bedingungen, wie sie nur bei einer vollständig serumfreien Kultivierung der Zellen vorliegen.
Da weder reife Hepatozyten noch ihre Vorläuferzellen spezifische Oberflächenmarker besitzen, die eine Isolierung mittels Durchflusszytometrie ohne weiteres ermöglichen, wurde versucht, ein Reportersystem zu schaffen, das eine Identifizierung und Isolierung der Zellen zu verschiedenen Zeitpunkten des Differenzierungsprotokolls ermöglicht. Dafür wurden für verschiedene Fluoreszenzproteine kodierende Sequenzen hinter ein Transthyretin-, ein Albumin- bzw. ein Glukose-6-Phosphatase-Promotor-Konstrukt kloniert. Diese Promotoren werden im Zuge der hepatozytenspezifischen Differenzierung aktiviert. Die Konstrukte sollten stabil in das Genom undifferenzierter ES-Zelllinien integriert werden, um so eine zell- bzw. entwicklungsspezifische Expression der Reportergene während des Differenzierungsprozesses zu ermöglichen. Hierfür wurden zwei Verfahren getestet: Zum einen wurde versucht, die transgenen ES-Zellen mittels retroviralem Gentransfer zu erzeugen. Die Infektion der ES-Zellen mit den rekombinanten Viren führte jedoch zu keiner funktionalen Zelllinie. Zum anderen wurde versucht, die Reporterkonstrukte über homologe Rekombination gezielt in den während der Embryonalentwicklung ubiquitär exprimierten ROSA26-Lokus zu integrieren. Hierdurch wurden mit hoher Effizienz Zelllinien generiert, welche die Reporterkonstrukte stabil integriert haben. Im Falle des Albumin-Promotor-Konstruktes wurde so eine Zelllinie erzeugt, in der eine differenzierungsspezifische Synthese des enhanced green fluorescent protein beobachtet werden kann. Dies zeigt, dass diese Methode grundsätzlich geeignet ist, ein solches Reportersystem zügig zu erzeugen, um so den Differenzierungsverlauf analysieren zu können.
Translation of the abstract (English)
The organogenesis of higher animals is a complex process and depends on multiple interactions between cells of different tissues. The isolation of embryonic stem cells (ES cells) and the discovery that these cells can differentiate into a number of mature somatic cells even in vitro, offer a new system to study the formation of different cell types during mammalian development. The publication of ...
Translation of the abstract (English)
The organogenesis of higher animals is a complex process and depends on multiple interactions between cells of different tissues. The isolation of embryonic stem cells (ES cells) and the discovery that these cells can differentiate into a number of mature somatic cells even in vitro, offer a new system to study the formation of different cell types during mammalian development. The publication of several protocols that allow the generation of hepatocyte-like cells from murine ES cells in vitro, now also offers the opportunity to investigate the organogenesis of the liver in this system.
Beyond functional analysis of external trans-acting factors with respect to the differentiation process, differential gene expression experiments could lead to the discovery of new genes that are relevant for hepatocyte development. For this purpose the prerequisites are efficient differentiation protocols and a simple way to identify and isolate hepatic precursor cells at different times of the differentiation process. To this end a differentiation protocol based on the publication of Takashi Hamazaki et al. in 2001 was established. This protocol is based on the generation of the three embryonic germ layers in three-dimensional aggregates, so called embryoid bodies, and a following differentiation of entodermal cells into mature hapatocytes promoted by the addition of external growth factors. This protocol could be further optimised by a slight adjustment of the time of factor addition with regard to the differentiation behaviour of the cell line used and by using different preparations of animal serum. The serious differences in hepatocyte specific gene expression following the application of different serum preparations demonstrate the great importance of serum factors for the differentiation process. Additionally, the result shows that even minor variations in their composition can influence the outcome of an experiment considerably. This also points to the importance of well-defined differentiation conditions if one wants to compare the results of different research groups or study the influence of external factors. Additionally, modifications tested by other groups, such as a temporary serum starvation or the use of fibroblast growth factor-4 to promote hepatic differentiation in a monolayer based differentiation protocol, did not show the desired results in the established protocol but instead led to a decrease of hepatocyte specific gene expression after the differentiation process.
As neither mature hepatocytes nor their precursors possess appropriate surface markers that allow their isolation via flow cytometry, a reporter system should be generated that facilitates the identification and isolation of differentiated cells at different times of the differentiation process. For this purpose, the coding sequences of different fluorescent proteins were inserted behind a transthyretin, an albumin and a glucose-6-phosphatase promoter construct, respectively. These promoters are activated at different stages during the differentiation process to hepatocytes. These constructs should be integrated stably into the genome of undifferentiated ES cells. During the differentiation process these cells should allow a reporter gene expression specific to the cell type and the developmental stage. To this end two different procedures of gene transfer were tested: First, a retroviral gene transfer by recombinant Moloney Murine Leukemia Virus (MMLV), second the homologues recombinations of the reporter constructs into the ubiquitously expressed ROSA26 locus.
The infection of ES cells with recombinant MMLV particles did not result in any functional cell lines. However, the integration of the expression cassettes into the ROSA26 locus was very efficient and allowed the generation of multiple transgenic cell lines that harboured stable inserts of the reporter constructs. In the case of the albumin reporter, it was possible to establish a cell line that shows a specific synthesis of the fluorescent protein in differentiating cells and which now should facilitate the isolation of hepatic cells during the differentiation process. This also shows that the integration of cell specific reporter constructs into the ROSA26 locus is an efficient way to generate transgenic reporter cell lines.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 12:46
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