Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit der Funktion der TNF-R1-Internalisierung. Dazu sollte das für die Internalisierung notwendige Aminosäuremotiv identifiziert werden. In unserer Arbeitsgruppe konnte durch in vitro-Mutagenese eine zytoplasmatische Domäne des TNF-R1 gefunden werden, nach deren Deletion die Internalisierung des TNF-R1 blockiert ist. Dieser als TRID (TNF-R1 internalization domain) bezeichnete Bereich enthält das kanonische Internalisierungsmotiv YXXPhi. Um zu prüfen, ob YXXPhi für die Internalisierung des TNF-R1 verantwortlich ist, wurden TNF-R1-Konstrukte hergestellt, denen entweder die TRID fehlte oder deren YXXPhi-Motiv mutiert worden war. Anschließend wurden die TNF-R1-Konstrukte in TNF-R1/TNF-R2-defizienten Zellen stabil zur Expression gebracht. Die Mutation des YXXF-Motivs resultierte ebenso wie eine Deletion der gesamten TRID in einer vollständigen Blockierung der TNF-R1-Internalisierung. Diese Ergebnisse zeigten klar, dass YXXPhi das für die TNF-R1-Internalisierung essentielle Aminosäuremotiv darstellt.
Bisherige Studien zeigten, dass eine pharmakologische Blockierung der TNF-R1-Internalisierung die TNF-induzierte Apoptose inhibiert. Der TNF-R1 vermittelt Apoptose durch Rekrutierung eines DISC (death inducing signaling complex) aus den Proteinen TRADD, FADD und Caspase-8 an die intrazelluläre Todesdomäne. Mit Hilfe der hergestellten Zellen, die internalisierungsdefiziente TNF-Rezeptoren exprimierten, sollte der Einfluss der TNF-R1-Internalisierung auf die Bildung des DISC näher untersucht werden. Dabei stellte sich das Problem, dass in allen bisherigen Studien die DISC-Rekrutierung unter physiologischen Bedingungen nicht nachgewiesen werden konnte. Daher wurden in dieser Arbeit durch eine eigens hierfür entwickelte Apparatur immunomagnetische TNF-R1-Vesikel nach Stimulation mit TNF isoliert und analysiert. Durch diesen neuen methodischen Ansatz konnte zum ersten Mal die Rekrutierung des DISC an den TNF-R1 unter physiologischen Bedingungen bewiesen werden. Darüber hinaus wurde anhand der internalisierungsdefizienten TNF-R1-Konstrukte gezeigt, dass die Blockierung der TNF-R1-Internalisierung zu einem Ausbleiben des DISC führt und damit die Voraussetzung zur Apoptoseinduktion verhindert. Es wurde jedoch festgestellt, dass Zellen mit internalisierungsdefizienten TNF-Rezeptoren auf TNF hypersensitiv reagieren. In den entsprechenden TNF-Zytotoxizitätstests waren die Zellen mit einem Proteinsynthesehemmer vorbehandelt worden. Parallel durchgeführte Versuche in unserer Arbeitsgruppe zeigten, dass eine TNF-R1-Internalisierungsdefizienz Zellen in Abwesenheit eines Proteinsynthesehemmers vor TNF schützt. Unter den Bedingungen der TNF-R1-Internalisierungsdefizienz und gleichzeitiger Verwendung eines Proteinsynthesehemmers war also Apoptoseinduktion trotz einer fehlenden DISC-Rekrutierung möglich. Am wahrscheinlichsten erschien eine Apoptoseinduktion durch eine erhöhte Aktivität des Enzyms N-SMase, da dieses durch den TNF-R1 aktiviert werden kann und proapoptotische Ceramide erzeugt. Diese Hypothese wurde durch die Feststellung einer hohen N-SMase-Aktivität in Zellen mit internalisierungsdefizienten TNF-Rezeptoren belegt. Daher wurde ein TNF-R1-Konstrukt hergestellt, das weder die TRID noch die Domäne zur N-SMase-Aktivierung besaß. Zellen mit diesem TNF-R1 waren gegenüber TNF resistent und zeigten eine geringe N-SMase-Aktivität. Somit konnte gezeigt werden, dass die TNF-R1-Internalisierung die Voraussetzung für die DISC-vermittelte Apoptose darstellt. Weiterhin wurde eine alternative Apoptoseinduktion durch Aktivierung der N-SMase gefunden, für die aber ein internalisierungsdefizienter TNF-R1 und die Verwendung eines Proteinsynthesehemmers Voraussetzung waren.
Nachdem gezeigt wurde, dass die TNF-R1-Internalisierung für die TNF-induzierte Apoptose essentiell ist, sollte untersucht werden, welche Rolle die TNF-R1-Internalisierung in der Zellbiologie spielen könnte. Das in der E3-Region des adenoviralen Genoms kodierte Protein E3-14.7K ist in Mauszellen ein Inhibitor der TNF-induzierten Apoptose. In Vorarbeiten unserer Arbeitsgruppe wurde gezeigt, dass die Expression von E3-14.K in Mauszellen zur TNF-Resistenz aufgrund einer Blockierung der TNF-R1-Internalisierung und eines Ausbleibens der DISC-Rekrutierung führt. In der vorliegenden Arbeit konnte demonstriert werden, dass in humane Zellen E3-14.7K ebenfalls TNF-Resistenz vermittelt und dies, wie in murinen Zellen, auf einer Blockierung der TNF-R1-Internalisierung beruht. Dieser Resistenzmechanismus wurde sowohl in E3-14.7K-transduzierten Zellen als auch unter den pathophysiologischen Bedingungen einer Virusinfektion gefunden. Weiterhin zeigten die Experimente mit infizierten Zellen entgegen bisherigen Studien, dass E3-14.7K als einziges E3-kodiertes Protein vor TNF-induzierter Apoptose schützt.

This study describes the function of the internalization of the TNF-R1. For that purpose the aminoacid motif nacessary for internalization was identified. Our group found a domain within the cytoplasmatic part of the TNF-R1 that is crucial for internalization. This domain, called TRID for TNF-R1 internalization domain, contains the canonical internalization motif YXXPhi. Deletion of TRID or the exchange of tryptophan within the putative internalization motif resulted in complete blockage of TNF-R1-internalization.
Upon activation, a protein complex called DISC is recruited to the TNF-R1. Recruitment of the DISC results in induction of apoptosis. However, in contrast to other death receptors, the DISC-recruitment to the TNF-R1 was never directly shown by common methods, calling for new innovative experimental approaches. Therefore, vesicles harbouring the internalized TNF-R1 were isolated using a custom-built magnetic free-flow chamber. After isolation of internalized TNF-receptosomes, recruitment of the DISC proteins could be detected. DISC-recruitment was only observed in TNF-R1 wildtype receptosomes, while deletion of TRID or mutation of the internalization motif resulted in complete loss of DISC-assembly. Next, the susceptibility of mouse fibroblast expressing either the wt-TNF-R1 or a mutated TNF-R1 to TNF treatment was measured. Although not able to recruit the DISC, mutated TNF-receptors induced apoptosis even more effectivly than the wt-TNF-R1. Induction of apoptosos in these cells was likely induced independently of the DISC by improved induction of the membrane-bound enzyme N-SMase and therefore production of high levels of proapoptotic ceramids. To proove this hypothesis, N-SMase activity regarding to the TNF-R1 mutants was meassured. N-SMase activity was greatly improved in cells expressing a internalization-defecient TNF-R1. Furthermore, deletion of TRID and the activation domain for N-SMase resulted in TNF-resistance. Thus, internalization of the TNF-R1 is neccessary for DISC-dependent induction of apoptosis, while activation of a internalization-defecient TNF-R1 caused by mutation of the inetrnalization motif results in apoptosis due to high activation of N-SMase.
E3-14.7K is protein encoded in the E3-Region of adenoviruses. E3-14.7K is a repressor of TNF-induced apoptosis in mouse cells. However, the mechanisms by which expressing of E3-14.7K results in TNF-resistance, was unknown up to date.Because in the first part of this study ist was prooved that internalization of the TNF-R1 is absolutely necessary for induction of apoptosis, the influence of E3-14.7K on internalization of TNF-R1 and recruitment of the DISC was observed in mouse and human cells under the conditions of infection. Expression of E3-14.7K resulted in a complete blockage of TNF-R1-internalization, DISC-assembly and TNF-induced lysis of cells. Additionally is was shown, that E3-14.7K is the only E3-encoded protein that is able to protect cells of TNF-lysis. In summary, this study demonstrates that internalization of TNF-R1, DISC-assembly and induction of apoptosis are inseparable events. The phsiological relevance of this relationship was prooved by two completely independet experimental setups.