| License: Publishing license for publications including print on demand (3MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-8767
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.10614
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 17 December 2007 |
| Referee: | Michael (PD Dr.) Rehli |
| Date of exam: | 17 September 2007 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Innere Medizin III (Hämatologie und Internistische Onkologie) Biology, Preclinical Medicine |
| Keywords: | Toll-like-Rezeptoren , Genregulation , Footprinting , Monozyten-Makrophagen-System , Chromatin , Promotor <Genetik> , Epithelzellen , Transkriptionsfaktoren , Toll-like receptors , transcriptional regulation , in vivo footprinting , monocytes-macrophages , transcription factors |
| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 10614 |
Abstract (German)
Toll-like Rezeptoren (TLRs) sind konservierte �Pattern Recognition Receptors� (PRRs) der angeborenen Immunabwehr, die sich jedoch während der Evolution in ihren regulatorischen Bereichen zum Teil stark verändert haben. Dies hat zur Folge, dass sich verschiedene Spezies in der Expression der TLRs unterscheiden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Genpromotoren von TLR4 sowie TLR5 und TLR9 in Mensch ...
Abstract (German)
Toll-like Rezeptoren (TLRs) sind konservierte �Pattern Recognition Receptors� (PRRs) der angeborenen Immunabwehr, die sich jedoch während der Evolution in ihren regulatorischen Bereichen zum Teil stark verändert haben. Dies hat zur Folge, dass sich verschiedene Spezies in der Expression der TLRs unterscheiden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Genpromotoren von TLR4 sowie TLR5 und TLR9 in Mensch und Maus hinsichtlich ihrer unterschiedlichen Expression auf Ebene der Transkription untersucht.
Die Expression von TLR4 erfolgt in murinen und humanen Makrophagen ähnlich. In vivo Footprints zeigten, dass die gleichen Bindestellen, darunter mehrere PU.1-Motive, eine IRF/Ets-Bindestelle und eine AP-1/E-Box für die Transkription wichtig sind. Außerdem werden die gleichen Transkriptionsstarts (TSS) verwendet. Der für den humanen TLR4 Promotor bereits publizierte Nachweis der essentiellen PU.1- und ICSBP-Bindung (EMSA, Reportergenanalysen) konnte für den murinen Tlr4 Promotor nur für den Transkriptionsfaktor PU.1 erbracht werden. Während eine starke PU.1 Bindung auch in vivo am murinen Promotor (ChIP Experimente) nachgewiesen wurde, konnte anhand von Icsbp-defizienten Makrophagen gezeigt werden, dass der Transkriptionsfaktor Icsbp nicht für die Expression von Tlr4 nötig ist. Die konservierte, mit Footprints versehene AP1/E-Box war in beiden Spezies wichtig, wobei eine Bindung von AP1 ausgeschlossen wurde. Für die Transkription konnten E-Box-bindende Faktoren verantwortlich gemacht werden, darunter wurden in Makrophagen bisher Faktoren aus der USF-Familie identifiziert (ChIP, EMSA).
Bezüglich der Reporteranalysen muriner Tlr4 Promotorkonstrukte, war für die Interpretation der transkriptionellen Regulation dieses Gens ein sehr wichtiges Ergebnis, dass transiente Transfektionen in Makrophagen nicht in vivo Ereignisse der Tlr4 Transkription in Mausmakrophagen wiedergeben. Gründe dafür wurden in der Diskussion erörtert.
Durch TSS-Analysen unterschiedlicher Zelltypen mittels 5�-RLM-RACE-PCR wurde in beiden Spezies erstmals ein alternativer distaler Promotor in nicht-myeloischen Zellen, ungefähr 200 bp stromaufwärts vom proximalen myeloischen Promotor, definiert. Interessanterweise wird dieser in intestinalen Epithelzellen der Maus ausschließlich verwendet, während in entsprechenden humanen Zellen beide Promotoren funktionell sind. Die bevorzugte Verwendung des proximalen Promotors in nicht-myeloischen Zellen wurde durch das Vorhandensein nicht-konservierter Elemente (GC-Box, INR-Motiv) erklärt die den proximalen humanen TLR4 Promotor stabilisieren.
In nicht-myeloischen Zellen der Maus ist die AP1/E-Box für die Regulation des distalen Promotors das wichtigste Element. Im Gegensatz zur Besetzung dieses Motivs in Makrophagen mit USF-Faktoren wurde eine Bindung dieser Faktoren in nicht-myeloischen Zellen ausgeschlossen, dafür wurden aber Hinweise auf die Rekrutierung anderer E-Box-bindender Faktoren wie TFEB und TFE3 erbracht.
Zum ersten Mal konnte am Beispiel des murinen Tlr4 Gens gezeigt werden, dass alleine der myeloische Transkriptionsfaktor PU.1, der eine Reihe typisch myeloischer Promotoren kontrolliert, in der Lage ist den Transkriptionsstart festzulegen. Mittels der konditionell PU.1-induzierbaren Vorläuferzelllinie PUER wurde unmittelbar nach PU.1-Aktivierung die Verschiebung des TSS vom distalen nicht-myeloischen Promotor hin zum proximalen myeloischen Promotor nachgewiesen. Parallel durchgeführte Tlr4 mRNA Analysen weisen auf eine wesentlich geringere Transkriptionsrate des distalen im Vergleich zum proximalen Promotor hin.
Für die TLR5 Gene wurde gezeigt, dass sich die Promotoren von Mensch und Maus stark unterscheiden. Bereits beschriebene deutliche Unterschiede der Spezies-spezifischen Expression von TLR5 konnten jedoch nicht bestätigt werden und im Widerspruch zur Literatur wurde auch eine Expression in Mausmakrophagen nachgewiesen.
Trotz der beschriebenen Spezies-spezifischen Expression von TLR9 sind die Promotoren von Mensch und Maus über weite Bereiche konserviert und weisen ähnliche regulatorische Elemente (PU.1, AP1, IRF/Ets) wie im TLR4 Promotor auf. In dem Kollaborationsprojekt mit K. Schroder wurde durch die Untersuchung von Makrophagen aus Icsbp-defizienten Mäusen gezeigt, dass Icsbp ein unerlässlicher Transkriptionsfaktor für die basale und IFN-gamma-induzierte Tlr9 Expression ist.
Neben der transkriptionellen Kontrolle weisen upstream ATGs in ungefähr 80% der TLR Gene auf eine zusätzliche translationale Kontrolle hin. Am Beispiel des TLR4 Gens konnte gezeigt werden, dass zwei nicht-konservierte uATGs in der Maus zu einem starken Verlust der Reportergenexpression im Vergleich zum humanen Promotorkonstrukt führte.
Translation of the abstract (English)
Toll-like Receptors (TLRs) are conserved pattern recognition receptors (PRRs) in innate immunity. During evolution human and mouse accumulated alterations in their regulatory regions, which lead to a species-specific TLR expression. This study shows the promoter analysis of human and murine TLR4, TLR5 and TLR9 in regard to their transcriptional regulation. Man and mouse show markedly different ...
Translation of the abstract (English)
Toll-like Receptors (TLRs) are conserved pattern recognition receptors (PRRs) in innate immunity. During evolution human and mouse accumulated alterations in their regulatory regions, which lead to a species-specific TLR expression. This study shows the promoter analysis of human and murine TLR4, TLR5 and TLR9 in regard to their transcriptional regulation.
Man and mouse show markedly different sensitivities towards bacterial endotoxins and recent evidence suggests that a species-specific regulation of the LPS receptor Toll-like receptor 4 may contribute to this phenomenon. To gain further insight into mechanisms of Tlr4 regulation, we conducted a detailed in vivo and in vitro study of the murine Tlr4 gene, including transcription start site location, analysis of transcription factor occupancy and activities of its proximal regulatory sequences. Our analyses identified a PU.1-dependent myeloid promoter which is conserved between man and mouse. We also identified an additional, distal promoter, located approximately 200 bp upstream of the myeloid-specific promoter which is a functional target of E-box binding factors. In contrast to humans where non-myeloid cells utilize both promoters, the distal murine Tlr4 promoter initiates all Tlr4 transcripts in non-myeloid cells, indicating that species-specific differences in TLR4 mRNA regulation may primarily exist in non-myeloid cell types. Interestingly, PU.1 null murine myeloid progenitor cells predominantly use the distal promoter and the conditional induction of PU.1 expression in these cells leads to the rapid switch of transcription initiation to the proximal myeloid promoter. This indicates a direct role for PU.1 in determining the transcriptional start site and in recruiting the basal transcription machinery to myeloid promoters.
In contrast to TLR4 the TLR5 promoters from man and mouse are not conserved. We could not confirm the described species-specific TLR5 expression and showed Tlr5 mRNA also in murine macrophages.
The TLR9 sequence alignment of different species showed a conserved promoter which contains similar regulatory elements, PU.1, AP1 and IRF/Ets motifs, like the TLR4 promoter. Icsbp was found to be an indispensable transcription factor for constitutive and IFN-gamma-inducible Tlr9 mRNA expression in murine bone marrow macrophages.
In terms of translation efficiency, we found upstream ATGs in about 80% of TLR genes. Previous studies showed that open reading frames created by upstream ATGs can control gene expression by a translational mechanisms. We identified two mouse-specific out-of-frame ATGs in the murine Tlr4 promoter that markedly influenced luciferase activity in reporter gene assays.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 12:38
Owner only: item control page
Download Statistics