| License: Publishing license for publications excluding print on demand (7MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-9155
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.10721
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 13 July 2008 |
| Referee: | Ludwig (Prof. Dr.) Lehle |
| Date of exam: | 14 December 2007 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Pflanzenwissenschaften > Lehrstuhl für Zellbiologie und Pflanzenphysiologie (Prof. Dr. Klaus Grasser) |
| Keywords: | Apoptosis , Bäckerhefe , Saccharomyces cerevisiae , N-Glykosylierung , Autophagozytose , Kex1p , apoptosis , yeast , N-glycosylation , autophagy , Kex1p |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 10721 |
Abstract (German)
Die Protein N-Glykosylierung im Endoplasmatischen Retikulum stellt eine essentielle Proteinmodifikation dar, die von der Hefe bis zum Menschen stark konserviert ist. Der zentrale Schritt dieses Signalwegs ist der Transfer des lipidgebundenen Core-Oligosaccharids auf die naszierende Polypeptidkette, der durch einen Multienzymkomplex, der Oligosaccharyltransferase, katalysiert wird. In der ...
Abstract (German)
Die Protein N-Glykosylierung im Endoplasmatischen Retikulum stellt eine essentielle Proteinmodifikation dar, die von der Hefe bis zum Menschen stark konserviert ist. Der zentrale Schritt dieses Signalwegs ist der Transfer des lipidgebundenen Core-Oligosaccharids auf die naszierende Polypeptidkette, der durch einen Multienzymkomplex, der Oligosaccharyltransferase, katalysiert wird. In der N-glykosylierungsdefizienten, temperatursensitiven Oligosaccharyltransferasemutante wbp1-1 konnten bei restriktiver Temperatur typische apoptotische Phänotypen wie Chromatinkondensation, DNA-Fragmentierung, Phosphatidylserintranslokation, ROS-Produktion, caspaseähnliche Aktivität und eine Fragmentierung des tubulären mitochondriellen Netzwerks nachgewiesen werden. Durch Disruption von Uth1p, einem Protein das für die Mitochondrienfragmentierung notwendig ist, konnten die untersuchten apoptotischen Phänotypen unterdrückt werden. Ebenso war in Anwesenheit des antioxidierenden Agens Glutathion oder von N-Acetyl-L-Cystein die ROS-Akkumulation wie auch die caspaseähnliche Aktivität reduziert bzw. die Überlebensrate der Zellen verbessert.
Im Säuger kommt dem anti-apoptotischen Protein Bcl-2 eine bedeutende Rolle bei der Hemmung der Apoptose zu. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass durch heterologe Expression des humanen Bcl-2 apoptotische Merkmale reduziert und die Überlebensrate erhöht wurden. Dies deutet darauf hin, dass in Hefe ein Protein mit ähnlicher Funktion existiert.
Die genannten Befunde in der wbp1-1 Mutante ließen sich auch im Wildtyp nach Hemmung der N-Glykosylierung durch Tunicamycin bestätigen. Bei einer Inkubationstemperatur von 37 °C wurden eine caspaseähnliche Aktivität und ROS-Akkumulation detektiert, die wiederum durch Hemmung der Proteinneusynthese durch Cycloheximid, durch Reduktion reaktiver Sauerstoffspezies mit N-Acetyl-L-Cystein oder durch Hemmung von caspaseähnlichen Proteasen mit dem aus Säugern bekannten Caspaseinhibitor zVAD-FMK vermindert werden konnten. Durch Inkubation der Zellen mit Tunicamycin konnte ebenfalls eine Veränderung in der Mitochondrienmorphologie nachgewiesen werden.
Eine Beteiligung der in Hefe identifizierten Metacaspase Yca1p in dieser Signalkaskade des programmierten Zelltods (PCD) konnte durch Disruption von YCA1 in wbp1-1 ausgeschlossen werden. Dagegen ließ sich für die im Golgi-Apparat präsente Protease Kex1p eine Beteiligung in diesem Signalweg nachweisen. Die Disruption von Kex1p führte zu einer Verminderung der caspaseähnlichen Aktivität, zur ROS-Akkumulation, Fragmentierung der Mitochondrien und Schrumpfung der Zellen und verbesserte das Wachstumsverhalten und die Überlebensrate von wbp1-1. Da Kex1p auch beim PCD in chronologisch gealterten oder mit Essigsäure gestressten Zellen eine Rolle spielt, könnte dieser Protease eine allgemeine Bedeutung während des PCD zukommen.
Für einige Proteine ist in der Literatur belegt, dass sie bei apoptotischen Signalkaskaden in S. cerevisiae eine wichtige Rolle einnehmen. Um deren Funktion beim PCD aufgrund defekter N-Glykosylierung zu untersuchen, wurden die Gene AIF1, NDI1 und NMA111 in wbp1-1 disruptiert bzw. überexprimiert und caspaseähnliche Aktivität, ROS-Akkumulation und die Überlebensrate untersucht. Doch weder Überexpression (AIF1), noch Disruption (AIF1, NDI1 und NMA111) hatten einen Einfluss auf die analysierten apoptotischen Phänotypen.
Neben Apoptose wurde in den letzten Jahren erkannt, dass auch Autophagozytose eine Form des programmierten Zelltods darstellt. Bei der Auswertung einer Transkriptomanalyse, in der das Transkriptom von wbp1-1 inkubiert bei 25°C mit dem Transkriptom von wbp1-1 inkubiert für 4 h bei 37 °C verglichen wurde, fiel auf, dass neben Atg8p, das als Markerprotein für die Induktion von Autophagozytose verwendet wird, 19 weitere autophagozytotische Proteine mindestens um den Faktor 2 hochreguliert wurden. Dies deutete darauf hin, dass auch Autophagozytosevorgänge in die vorliegende Signalkaskade involviert sind. Nach Disruption von ATG5 und ATG8, die in unterschiedlichen Schritten der Autophagozytose wirken, konnte eine Reduktion sowohl der caspaseähnlichen Aktivität, als auch der ROS-Akkumulation nachgewiesen werden. Dies traf sowohl für wbp1-1 als auch für den Wildtypstamm nach Inkubation mit Tunicamycin zu. Die Resultate legen nahe, dass das Auftreten apoptotischer Phänotypen eine funktionsfähige Autophagozytose benötigt.
Translation of the abstract (English)
Protein N-glycosylation in the endoplasmatic reticulum is an essential protein modification and highly conserved in evolution from yeast to man. The central step of this pathway is the transfer of the lipid-linked core-oligosaccharide to the nascent polypeptide chain, catalyzed by the oligosaccharyltransferase. In the N-glycosylation defective, temperature sensitive oligosaccharyl-transferase ...
Translation of the abstract (English)
Protein N-glycosylation in the endoplasmatic reticulum is an essential protein modification and highly conserved in evolution from yeast to man. The central step of this pathway is the transfer of the lipid-linked core-oligosaccharide to the nascent polypeptide chain, catalyzed by the oligosaccharyltransferase. In the N-glycosylation defective, temperature sensitive oligosaccharyl-transferase mutant wbp1-1, typical apoptotic phenotypes like chromatin condensation, DNA fragmentation, phosphatidylserine translocation, ROS production, caspase-like activity and fragmentation of the mitochondrial network were identified after incubation at restrictive temperature. Disruption of Uth1p, a protein necessary for mitochondrial fragmentation, suppresses several of the analyzed apoptotic phenotypes. Likewise addition of the antioxidant glutathione or N-acetyl-L-cysteine to the culture reduces ROS accumulation and caspase-like activity and improves survival of cells.
In mammals the anti-apoptotic protein Bcl-2 plays an important role during inhibition of apoptosis. In this study it was shown that heterologoues expression of the human Bcl-2 reduces apoptotic phenotypes and increases survival of cells. This indicates that in yeast a protein with similar function may exist.
The results obtained for the wbp1-1 mutant could be confirmed in wild-type yeast after inhibition of N-glycosylation by tunicamycin. At an incubation temperature of 37 °C caspase-like activity and ROS accumulation were detected. This could be reduced by inhibition of protein synthesis with cycloheximide, by reduction of reactive oxygen species with N-acetyl-L-cysteine or by inhibition of caspase-like proteases with the broad spectrum caspase inhibitor z-VAD-FMK. Moreover incubation of cells with tunicamycin leads to an alteration of the mitochondrial network.
An involvement of the yeast metacaspase Yca1p in this programmed cell death (PCD) signalling cascade was excluded after its disruption in wbp1-1. However it was shown for the Golgi protease Kex1p to participate in this pathway. Disruption of Kex1p diminishes caspase-like activity, ROS accumulation, fragmentation of the mitochondrial network and cell shrinkage and improves cell growth and survival of wbp1-1. Since involvement of Kex1p was shown in chronological aged cultures or in cultures treated with acetic acid, a general role of Kex1p in PCD is predicted.
For several proteins it is documented in the literature to play an important role in distinct apoptotic pathways in bakers yeast. To ascertain their function in PCD caused by defective N-glycosylation the genes AIF1, NDI1 and NMA111 were disrupted or overexpressed in wbp1-1 and caspase-like activity, ROS accumulation und survival rate was analyzed. But neither overexpression (AIF1) nor disruption (AIF1, NDI1 and NMA111) has any influence on the detected apoptotic markers.
In the last years the importance of autophagy as another form of programmed cell death has been recognized. After evaluation of a transcriptome analysis, in which the transcriptome of wbp1-1 incubated at 25 °C was compared with the transcriptome of wbp1-1 incubated for 4 h at 37 °C, it became clear that besides Atg8p, a marker protein for induction of autophagy, another 19 genes involved in the autophagic signalling cascade were upregulated at least twofold. This indicates that autophagy plays a role in the present pathway. After disruption of ATG5 and ATG8, which operate in different steps of autophagy, a reduction of caspase-like activity as well as ROS accumulation was detected. This was the case not only for wbp1-1, but also for wild-type yeast in the presence of tunicamycin. The results suggest that the appearance of apoptotic phenotypes requires a functional autophagic signalling cascade.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 12:31
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