| License: Publishing license for publications excluding print on demand (4MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-9549
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.10727
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 8 April 2008 |
| Referee: | Michael (Prof. Dr.) Thomm |
| Date of exam: | 28 January 2008 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Lehrstuhl für Mikrobiologie (Archaeenzentrum) > Prof. Dr. Michael Thomm |
| Keywords: | Cytomegalie-Virus , Frühe Gene , Immunreaktion , Interferon , STAT , Immunreaktion , Resistenz , Molekularbiologie , Angeborene Immunantwort , Jak-STAT-Signalkaskade , ISG , STAT2 , IE1-Protein , Innate immunity , Jak-STAT signalling , ISG , STAT2 , IE1 protein |
| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 10727 |
Abstract (German)
Wirbeltiere haben als Teil der angeborenen Immunabwehr im Laufe der Evolution ein höchst komplexes Interferon (IFN)-System entwickelt, welches das Potenzial besitzt Infektionen mit Viren und anderen Pathogenen zu unterbinden. Im Gegenzug dazu haben Viren wie das humane Zytomegalievirus (HCMV) zahlreiche Mechanismen entwickelt, die es ihnen ermöglichen der IFN-Antwort zu entkommen und im ...
Abstract (German)
Wirbeltiere haben als Teil der angeborenen Immunabwehr im Laufe der Evolution ein höchst komplexes Interferon (IFN)-System entwickelt, welches das Potenzial besitzt Infektionen mit Viren und anderen Pathogenen zu unterbinden. Im Gegenzug dazu haben Viren wie das humane Zytomegalievirus (HCMV) zahlreiche Mechanismen entwickelt, die es ihnen ermöglichen der IFN-Antwort zu entkommen und im Wirtsorganismus zu persistieren. Die antivirale Immunantwort, die über Sekretion von Typ 1 IFN zur Induktion IFN-stimulierter Gene (ISG) führt, wird in zwei Phasen unterteilt. In Phase 1 lösen bereits die ersten Virus-Zell-Kontakte eine Reihe von molekularen Ereignissen aus, die in der Induktion des IFN-beta-Gens münden. Sezerniertes IFN-beta aktiviert dann, durch Bindung an seinen Rezeptor auf der Zelloberfläche, den so genannten janus kinase-signal transducer and activator of transcription (Jak-STAT)-Signaltransduktionsweg (Phase 2). Der im Kontext dieser Signalkaskade aus den Proteinen STAT1, STAT2 und IFN regulatory factor 9 (IRF9) gebildete trimere Komplex führt nach Phosphorylierung, nukleärer Translokation und sequenzspezifischer DNA-Bindung letztendlich zur transkriptionellen Aktivierung zahlreicher antiviraler Gene.
Es wurde postuliert, dass mindestens ein unmittelbar nach Infektion neu synthetisiertes HCMV-Genprodukt die Induktion dieser ISG unterdrücken kann. Die ersten nach HCMV-Infektion produzierten viralen Genprodukte werden in der Klasse der immediate-early (IE)-Proteine zusammengefasst. In der vorliegenden Arbeit sollte untersucht werden, inwiefern das virale 72kDa IE1-Protein diese Aufgabe übernimmt und welcher molekulare Mechanismus dieser Aktivität gegebenenfalls zugrunde liegt.
Durch vergleichende Wachstumsanalysen mit einem Wildtyp-Virus und einer IE1-defizienten Virusmutante konnte zunächst gezeigt werden, dass die HCMV-Infektion in primären humanen Fibroblasten durch virusinduziertes IFN-beta normalerweise nicht limitiert wird. In Anwesenheit des IE1-Proteins zeigte das Virus auch eine ausgeprägte Resistenz gegenüber relativ hohen Konzentrationen an zusätzlich exogen zugesetztem IFN, während sich die IE1-spezifische Virusmutante als IFN-hypersensitiv erwies.
Desweiteren wurde beobachtet, dass IE1 nur unwesentlich in die Phase 1 der IFN-abhängigen Immunantwort eingreift. Dagegen konnte gezeigt werden, dass das virale Protein die Induktion von mindestens zwei IFN-stimulierten, potenziell antiviralen humanen Transkripten im weiteren Verlauf der Infektion (Phase 2 der IFN-Antwort) effizient unterdrücken kann. Die reprimierenden Effekte von IE1 waren dabei unabhängig von anderen HCMV-Genprodukten.
An Hand von Western Blot- und Immunfluoreszenz-Analysen konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass das virale Protein weder die Gleichgewichtsmengen, noch den Phosphorylierungstatus oder die nukleäre Translokation von STAT1, STAT2 oder IRF9 negativ beeinflusst. Dagegen konnte mit Hilfe von subzellulären Fraktionierungsverfahren eine IE1-abhängige Retention von aktiviertem STAT1 und STAT2 im Zellkern nachgewiesen werden. Außerdem wurde eine spezifische Kolokalisation zwischen IE1 und den Komponenten des trimeren Komplexes im Zellkern beobachtet, die auf eine subnukleäre Sequestrierung und Delokalisation der zellulären Proteine durch IE1 hindeutet. Dementsprechend zeigten Chromatinimmunpräzipitationen, dass IE1 mit der sequenzspezifischen DNA-Assoziation von STAT1, STAT2 und IRF9 an Promotoren von ISG interferiert.
Schließlich konnte durch Koimmunpräzipitationen aus infizierten Zellen und durch in vitro-Bindungsversuche eine physikalische Wechselwirkung zwischen dem IE1-Protein und STAT2 demonstriert werden. Während es sich bei der IE1-STAT2-Bindung vermutlich um eine direkte Wechselwirkung handelt, wurde für STAT1 eine indirekte Interaktion über STAT2 nachgewiesen. Zwischen IE1 und IRF9 war dagegen keine Bindung nachweisbar. Der für die physikalische Wechselwirkung mit STAT2 benötigte Bereich im IE1-Protein wurde auf eine 37 Aminosäuren umfassende Hauptinteraktionsdomäne im carboxyterminalen Abschnitt des viralen Proteins eingegrenzt. Für den zellulären Interaktionspartner erwiesen sich Abschnitte im aminoterminalen Bereich und in der zentralen DNA-Bindedomäne als kritisch für die Kolokalisation mit dem IE1-Protein.
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen erstmals, dass die IFN-Resistenz des HCMV in maßgeblicher Weise durch das virale IE1-Protein bestimmt wird. Die Induktion IFN-induzierter antiviraler Gene wird dabei über einen einzigartigen intranukleären Mechanismus blockiert.
Translation of the abstract (English)
During evolution vertebrates have developed a complex interferon (IFN) system as part of the innate immunity which enables them to fight viruses and other pathogens. In return, viruses like the Human Cytomegalovirus (HCMV) have developed multiple mechanisms to evade the IFN response leading to viral persistence in the host. The anti-viral IFN response is a biphasic process. In phase 1, the ...
Translation of the abstract (English)
During evolution vertebrates have developed a complex interferon (IFN) system as part of the innate immunity which enables them to fight viruses and other pathogens. In return, viruses like the Human Cytomegalovirus (HCMV) have developed multiple mechanisms to evade the IFN response leading to viral persistence in the host. The anti-viral IFN response is a biphasic process. In phase 1, the initial virus-cell interaction activates a series of molecular events which eventually lead to the induction of the IFN-beta gene. The binding of secreted IFN-beta to its cell surface receptor then activates the so called janus kinase-signal transducer and activator of transcription (Jak-STAT) pathway (phase 2). Activation of this pathway results in the formation of a trimeric complex consisting of the proteins STAT1, STAT2 and IFN regulatory factor 9 (IRF9). After phosphorylation, nuclear translocation and sequence-specific DNA-binding this complex mediates the transcriptional activation of numerous IFN-stimulated genes (ISGs) many of which have anti-viral activities.
Previous work has proposed that one or more newly synthesized HCMV gene products can block the induction of ISGs very early in infection. The first viral gene products expressed during HCMV infection are classified as immediate-early (IE) proteins. The aim of this work was to investigate a possible role of the viral 72kDa IE1 protein as an antagonist of the IFN-mediated host cell response and, if applicable, to study the underlying molecular mechanisms.
Growth analyses comparing wild type and an IE1-deficient mutant virus showed that HCMV infection is normally not limited by virus-induced endogenous IFN-beta in primary human fibroblasts. Additionally, the presence of the IE1 protein conferred resistance to relatively high concentrations of exogenous IFN-alpha on HCMV while the IE1-deficient mutant displayed an IFN hypersensitive phenotype.
Furthermore, the IE1 protein did not seem to interact in any major way with phase 1 of the IFN response. However, IE1 efficiently suppressed induction of at least two potentially anti-viral ISGs as infection progressed (phase 2 of the IFN response). These IE1-mediated effects proved to be independent of other HCMV gene products.
Using western blot and immunofluorescence analyses it could also be demonstrated that IE1 expression did not have any negative effects on the steady-state levels, phosphorylation or nuclear translocation of STAT1, STAT2 and IRF9. In contrast, an IE1-dependent nuclear retention of activated STAT1 and STAT2 was detected by cellular fractionation. Moreover, a specific nuclear colocalisation between IE1 and components of the trimeric complex was detected suggesting subnuclear sequestration and delocalisation of the cellular proteins by IE1. Accordingly, chromatin immunoprecipitation experiments showed that IE1 interferes with the sequence-specific DNA association of STAT1, STAT2 and IRF9 at promoters of ISGs.
Finally, co-immunoprecipitations from infected cells and in vitro protein capture assays demonstrated a physical interaction between IE1 and STAT2. The results suggested a direct interaction between IE1 and STAT2 and an indirect interaction with STAT1 via STAT2. In contrast, binding between IE1 and IRF9 has never been detected. A critical region in the IE1 protein required for the interaction with STAT2 was mapped to 37 amino acids in the carboxy-terminal domain of the viral protein. With respect to the cellular interaction partner, parts of the amino-terminal region and the central DNA binding domain appeared to be important for colocalisation with the IE1 protein.
These results show for the first time that the IFN resistance of HCMV is determined by the viral IE1 protein. In doing so, IE1 blocks the induction of IFN-induced anti-viral host genes by a unique intranuclear mechanism.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 12:30
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