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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-9680
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.10738
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 13 May 2008 |
| Referee: | Hans Robert (Prof. Dr. Dr.) Kalbitzer |
| Date of exam: | 23 April 2008 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Prof. Dr. Dr. Hans Robert Kalbitzer |
| Keywords: | Tight junction , Saccharomyces cerevisiae , Protein-Protein-Wechselwirkung , Zellkontakt , Signaltransduktion , Ras-Proteine , Zonula occludens-1 , Afadin , Ras-Signalkaskade , Agglutinin , Tight junction , protein-protein-interaction |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 10738 |
Abstract (German)
Die Ausbildung und Aufrechterhaltung interzellulärer Verbindungen ist ein entscheidendes Merkmal mehrzelliger Organismen. Eine Störung dieser Funktion führt dabei unweigerlich zu schwerwiegenden systemischen Erkrankungen, wie zum Beispiel Krebs. Die Kenntnis der molekularen Vorgänge bei der Bildung von Zell-Zell- Verbindungen ist deshalb von größter Bedeutung. Ziel dieser Arbeit war es, neue ...
Abstract (German)
Die Ausbildung und Aufrechterhaltung interzellulärer Verbindungen ist ein
entscheidendes Merkmal mehrzelliger Organismen. Eine Störung dieser Funktion
führt dabei unweigerlich zu schwerwiegenden systemischen Erkrankungen, wie zum
Beispiel Krebs. Die Kenntnis der molekularen Vorgänge bei der Bildung von Zell-Zell-
Verbindungen ist deshalb von größter Bedeutung.
Ziel dieser Arbeit war es, neue Erkenntnisse hinsichtlich dieser zellulären
Verbindungen zu gewinnen. Dabei wurden in der vorliegenden Arbeit zwei Ansätze
verfolgt. Zum einen sollten durch NMR-spektroskopische Untersuchungen am Hefe-
Zellwandprotein Aga2 von Saccharomyces cerevisiae Informationen über die
ursprünglichste Form der Zelladhäsion, der Agglutination, gewonnen werden. Zu
diesem Zweck sollte ein Präparationssystem etabliert werden, das es erlaubt, nativ
gefaltetes, rekombinantes Aga2 in großer Menge und in Reinform zu synthetisieren,
um es einer NMR-basierten Strukturaufklärung zugänglich zu machen. Dabei kamen
sowohl die klassische zelluläre Expression in E. coli, als auch die zellfreie In vitro
Expression zum Einsatz.
Dabei zeigte sich, dass Aga2 ausschließlich in ungelöster Form exprimiert wird. Eine
denaturierende Präparation mit anschließender Rückfaltung ergab ein Protein,
welches zu großen Teilen ungefaltet war. Aus diesem Grund wurde eine kombinierte
Präparation von Aga2 und dessen Anker-Untereinheit Aga1 durchgeführt. Während
eine Co-Expression keine Verbesserung hinsichtlich der Löslichkeit des Zielproteins
ergab, wurde durch eine gemeinsame Renaturierung der beiden Proteine eine
signifikante Verbesserung der Löslichkeit erreicht. Eine weitere Möglichkeit zur
Optimierung der Stabilität von Aga2 war die gezielte Mutagenese bestimmter
Aminosäuren des Proteins. So konnte durch die Austausche Y39F, C6S und C49S
eine signifikante Steigerung der Löslichkeit und Stabilität von Aga2 erreicht werden.
Allerdings stellte sich heraus, dass diese Mutante eine starke Zelltoxizität aufweist,
die eine zelluläre Expression des nativ gefalteten Zielproteins unmöglich machte.
Eine zellfreie Synthese des Proteins war dagegen erfolgreich. Es gelang erstmals,
lösliches und somit mutmaßlich nativ gefaltetes Aga2 zu exprimieren. Die geringe
Gesamtausbeute, die mit Hilfe dieser Methode erzielt werden konnte, erlaubte jedoch
keine Präparation im NMR-kompatiblen Maßstab. Durch die denaturierende
Präparation und Rückfaltung der Mutante konnte, wie bei der Co-Präparation mit
Aga1, eine Ausbeute an löslichem Zielprotein von nahezu 100% erreicht werden. Bei
der Analyse dieses synthetisch gefalteten Proteins stellte sich heraus, dass es zwar
eine hohe Stabilität aufweist, aber zu Aggregation neigt, was eine NMRspektroskopische
Untersuchung erheblich erschwert.
Ein weiterer Ansatz zur Gewinnung neuer Erkenntnisse hinsichtlich interzellulärer
Verbindungen bestand in der Untersuchung der Regulation einer speziellen Art
eukaryontischer Zell-Zell-Verbindungen, den sogenannten Tight Junctions. Dabei
wurde der Schwerpunkt auf die Charakterisierung einer möglichen Interaktion
zwischen dem Tight Junction Protein ZO-1 und dem Ras-Effektor AF6 gelegt, da es
sich hierbei um eine potentielle Schnittstelle zwischen der Regulation von
Zellwachstum und Proliferation und der Ausbildung und Aufrechterhaltung von
zellulären Verbindungen handeln könnte. Zu diesem Zweck sollte mit geeigneten
Methoden die Interaktion dieser beiden Proteine nachgewiesen werden. Zudem
sollte die AF6-bindende Domäne von ZO-1 sowie der komplemetäre Bereich auf der
Oberfläche von AF6 identifiziert werden, um daraus mögliche Rückschlüsse auf die
Funktion dieser beiden Komponenten im zellulären Kontext ziehen zu können.
Zu diesem Zweck wurden anhand biochemischer und biophysikalischer Methoden
zahlreiche Interaktionsstudien durchgeführt. Dazu wurden Expressionskonstrukte
angefertigt, die unterschiedliche konservierte Domänen von ZO-1 darstellten. Einige
dieser Konstrukte konnten im NMR-gerechten Maßstab exprimiert und gereinigt
werden. Dadurch war es möglich, mit Hilfe der NMR-Spektroskopie die Interaktion
von AF6 und ZO-1 zweifelsfrei nachzuweisen. Dabei gelang es, die zweite PDZDomäne
von ZO-1, die in der Literatur als Dimerisierungsdomäne beschrieben wird,
als AF6-Bindedomäne zu identifizieren. Durch Titrationsexperimente konnte
außerdem die Ras-Bindedomäne 1-141 von AF6 als Zo1-Bindedomäne identifiziert
werden. Durch die Isotopenmarkierung von AF6 war es zudem möglich, den für die
Zo1-Interaktion verantwortlichen Bereich auf der Moleküloberfläche von AF6
einzugrenzen. Dieser liegt N-terminal in direkter Nachbarschaft zu der für die
Ras/Rap1a-Bindung zuständigen Interaktionsfläche von AF6. Basierend auf diesen
Ergebnissen wurde schließlich ein neues Modell erstellt, das die Funktion der
Interaktion von AF6 und ZO-1 im zellulären Kontext erklärt. Demnach reguliert
Ras/Rap1a durch AF6 die ZO-1-abhängige Ausbildung interzellulärer Verbindungen.
Translation of the abstract (English)
Construction and maintenance of intercellular connections are crucial features of multicellular organisms. A distorsion of this function inevitably results in severe deseases such as cancer. Therefore the molecular processes involved in assembly of those cell-cell-contacts are of major importance. So the objective of this work was to gain knowledge about those cellular connections. For that ...
Translation of the abstract (English)
Construction and maintenance of intercellular connections are crucial features of multicellular organisms. A distorsion of this function inevitably results in severe deseases such as cancer. Therefore the molecular processes involved in assembly of those cell-cell-contacts are of major importance.
So the objective of this work was to gain knowledge about those cellular connections. For that purpose, two approaches have been persued. The first strategy was to gain information about the most primal form of cell adhesion, the agglutination, through NMR based analysis of the cell wall protein Aga2 from saccharomyces cerevisiae. To achieve this, a preparation system for synthesis of pure and native folded recombinant Aga2 had to be established. Both cellular expression in E. coli and a cell-free method were applied for this purpose.
Here I show, that Aga2 can only be expressed in an unsoluble state. The preparation under denaturating conditions resulted in an unfolded protein. For this reason a combined preparation of Aga2 and its anchorage subunit Aga1 was performed. Although a co-expression did not result in an improvement of the protein´s solubility, a significant improvement was achieved by a combined renaturation of both subunits. Site-directed mutagenesis of the protein was an alternative method for optimization of the stability of the protein. The changes Y39F, C6S and C49S resulted in a significant improvement of the solubility and stability of Aga2. The consequence was a high toxicity of the protein, which precluded its cellular expression. In contrast to this result, the cell-free expression was successful. But the small yield achieved by this method did not allow NMR-compatible preparation. By purification of the mutant under denaturating conditions and subsequent refolding soluble target protein could be achieved with a yield of almost 100%. The analysis of this synthetic folded protein showed it had a high degree of stability, but tended to aggregation, which would make a NMR spectroscopic investigation much more difficult.
Another approach for gaining new insights regarding cell-cell junctions was the investigation of the regulation of a particular type of eucaryotic intercellular connections, the tight junctions. The focus was the characterization of the putative interaction between the protein ZO-1 and the Ras-effector AF6 because this could be an interface between the regulation of cell growth and proliferation and the formation and maintenance of cellular junctions. For this purpose the interaction between these two proteins had to be proven. In addition, the AF6-binding domain of ZO-1 as well as the complementary area on the surface of AF6 had to be identified in order to draw conclusions on the function of those two proteins in the cellular context.
To this end, using biochemical and biophysical methods, several interaction assays were performed. In order to this, we produced expression constructs containing different conserved domains of ZO-1. Some of these constructs could be expressed and prepared in NMR-scale. So I was able to demonstrate the interaction of AF6 and ZO-1 with the help of NMR. In addition, I identified the second PDZ domain, previously described as self-binding domain, as the AF6-binding domain of ZO-1. By titration experiments the Ras-binding domain 1-141 of AF6 was identified to be responsible for interaction with ZO-1. Isotopic labelling of AF6 also allowed isolation of the interaction area on the surface of this protein. It is located in direct N-terminal neighbourhood of the interaction area responsible for Ras/Rap1a-binding. Based on these results, a novel scheme for describing of the cellular function of ZO-1 and AF6 was established. According to this, Ras/Rap1a regulates ZO-1-dependent formation of cell-cell junctions via AF6.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 12:28
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