| License: Publishing license for publications excluding print on demand (3MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-10227
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.10770
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Date: | 29 July 2008 |
| Referee: | Charalampos (Prof. Dr.) Aslanidis |
| Date of exam: | 11 June 2008 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Klinische Chemie und Laboratoriumsmedizin Biology, Preclinical Medicine |
| Keywords: | Fettsucht , Fettleber , Metabolisches Syndrom , Leber , Syntrophin , Genregulation , Leberepithelzelle , Diabetes mellitus , Fettzelle , Rezeptor , Adiponectin , Adiponectin Rezeptoren , Hepatozyten , adiponectin , adiponectin receptor , metabolic syndrome , fatty liver |
| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 10770 |
Abstract (German)
Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung potentieller Interaktionspartner der Adiponectin Rezeptoren und Untersuchungen zur Adiponectin induzierten Genexpression in Hepatozyten. Für fast alle Versuche wurden primäre humanen Hepatozyten verwendet, was für die Validität der Ergebnisse und deren in vivo Relevanz von entscheidender Bedeutung ist. Die Analyse der mRNA Expression von primären humanen ...
Abstract (German)
Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung potentieller Interaktionspartner der Adiponectin Rezeptoren und Untersuchungen zur Adiponectin induzierten Genexpression in Hepatozyten.
Für fast alle Versuche wurden primäre humanen Hepatozyten verwendet, was für die Validität der Ergebnisse und deren in vivo Relevanz von entscheidender Bedeutung ist. Die Analyse der mRNA Expression von primären humanen Hepatozyten, die mit HMW-Apm stimuliert wurden, zeigte, dass ca. 300 Gene durch HMW-Apm auf mRNA Ebene reguliert werden.
Die AOX1 wurde bisher meist aus pharmakologischer Sicht untersucht, weshalb über die Regulation dieses Proteins wenig bekannt ist. Es konnte gezeigt werden, dass AOX1 durch HMW-Apm und Fenofibrat über die Aktivierung von PPAR-alpha reprimiert wird. Da PPAR-alpha über die Bindung von Adiponectin an AdipoR2 reguliert wird, lässt sich sagen, dass AOX1 von HMW-Apm über AdipoR2 und PPAR-alpha reguliert wird. Die Daten zur erhöhten Expression der AOX1 in der Fettleber von Ratten müssen noch in entsprechenden humanen Proben untersucht werden. Wird dies bestätigt, eröffnen sich neue Fragen und Einblicke bezüglich des Einflusses von AOX1 auf den Stoffwechsel von Medikamenten und Xenobiotika in der verfetteten Leber.
Die Erkenntnisse zur Adiponectin vermittelten Signaltransduktion werden entscheidend durch die Identifizierung des Transkriptionsfaktors HNF4-alpha als ein durch HMW-Apm reprimiertes Protein ergänzt. So konnte gezeigt werden, dass HMW-Apm neben HNF4-alpha auch dessen Zielgene ApoB, ABCB4, GLUT2 und OCT1 reprimiert. Zusätzlich wurde eine verringerte Sekretion von ApoE gefunden, die wahrscheinlich durch die verminderte Freisetzung von ApoB bedingt ist. Eine reduzierte Sekretion von ApoB-haltigen hepatischen Lipoproteinen erklärt zum Teil die negative Assoziation von systemischen Adiponectin zu LDL. Vermindertes systemisches LDL führt sekundär zu einer Erhöhung von HDL, was sich in der positiven Korrelation von Adiponectin zu HDL ausdrückt.
Weiterhin konnte in dieser Arbeit das erste Mal gezeigt werden, dass AdipoR1 sowohl in primären humanen Hepatozyten als auch in hepatozytären Zelllinien exprimiert ist. In Hepatozyten wird AdipoR1 auf Proteinebene durch Fenofibrat reprimiert, während LXR/RXR Agonisten und Pioglitazon keinen Einfluss auf AdipoR1 haben. Dies legt den Schluss nahe, dass AdipoR1 in Hepatozyten kein direktes Zielgen dieser nukleären Rezeptoren ist.
Mit Hilfe von in vitro translatierten und rekombinant exprimierten AdipoR2 Protein konnte gezeigt werden, dass AdipoR2, anders als in der initialen Publikation mit 35,4 kDa beschrieben, ein 43 kDa Protein ist. Die zusätzlichen 75 Aminosäuren am N-Terminus von AdipoR2 zeigen keine Homologie zu AdipoR1, während die restlichen Aminosäuren eine hohe Ähnlichkeit dazu aufweisen.
In dieser Arbeit konnte weiterhin gezeigt werden, dass die Expression von AdipoR1 in der Fettleber aus Ratten unter Hochfettdiät nicht verändert ist, während die AdipoR2 mRNA induziert ist. In Mäusen mit einer durch Gallengangsligatur bedingten Leberzirrhose ist die mRNA Expression von AdipoR1 und AdipoR2 und die Menge an AdipoR1 Protein reduziert.
Die Interaktion von SNTA und SNTB2 mit den C-terminalen Bereichen der beiden Adiponectin Rezeptoren stellt das interessanteste Ergebnis dieser Arbeit dar. Die Interaktion zwischen diesen Proteinen wird über die PDZ Domäne von SNTA und SNTB2 vermittelt, die wahrscheinlich mit den PDZ Bindemotiven am C-Terminus von AdipoR1 und AdipoR2 wechselwirken. Es konnte nachgewiesen werden, dass die beiden Rezeptoren so in der Membran orientiert sind, dass der C-Terminus intrazellulär und der N-Terminus extrazellulär liegt. Die Interaktion mit SNTB2 und AdipoR1 oder AdipoR2 wurde durch die Stimulation mit HMW-Apm verstärkt, während die Maskierung der PDZ Bindedomäne der beiden Rezeptoren zu einem Verlust der Interaktion führt. Die funktionelle Bedeutung dieser Interaktion wurde mit siRNA Experimenten untersucht. Die Reduktion von SNTA durch siRNA führte zu einer Induktion von AdipoR1 auf Proteinebene, während der Knock-down von STNB2 zu einer Reduktion von AdipoR1 resultierte. Funktionell führte die Reduktion von SNTA und SNTB2 zu keiner Veränderung im Signalweg von Adiponectin über AdipoR2. Der Knock-down von SNTB2 reduzierte den Effekt von Adiponectin über AdipoR1, während die Reduktion von SNTA zu einer tendenziellen Verstärkung des Adiponectin Effekts über AdipoR1 führte. Dies deutet auf eine antagonistische Wirkung von SNTA und SNTB2 in der Funktion von AdipoR1 hin.
Um zu klären ob diese Interaktion auch in vivo von Bedeutung ist, wurden in Kooperation mit Marvin Adams die Lebern von SNTA-/-, SNTB2-/- und SNTA/B2-/- Knock-out Tieren untersucht. Ähnlich wie in den siRNA Experimenten führte das Fehlen von SNTA zu einer Induktion von AdipoR1, während die Defizienz von SNTB2 in einer Reduktion von AdipoR1 resultierte. Die Menge an AdipoR2 war im Gegensatz zu den SNTA-/- Mäusen, wo keine Veränderung von AdipoR2 zu beobachten ist, in den SNTB2-/- Mäusen reduziert. In den SNTA/B2-/- Doppel-Knock-out Tieren war AdipoR2 reduziert, während AdipoR1 Protein in der gleichen Menge enthalten war wie in den WT Tieren. In der metabolischen Charakterisierung zeigten die SNTA-/- und SNTB2-/- Tiere eine gestörte Glukosetoleranz, wohingegen die SNTA/B2-/- Tiere eine normale Gluksoetoleranz aufwiesen. Zusätzlich lag in den SNTB2-/- Tieren eine verringerte Insulinsensitivität vor. Dies unterstützt die in vitro Daten aus den siRNA Experimenten, dass SNTA und SNTB2 gegenteilige Effekte auf den Glukosestoffwechsel ausüben und dass das gleichzeitige Fehlen von SNTA und SNTB2 diese antagonistischen Effekte kompensiert.
Translation of the abstract (English)
The aim of the current thesis was the identification of adiponectin receptor interacting proteins and adiponectin regulated genes in hepatocytes. Primary human hepatocytes were used for the majority of the experiments, which is crucial for the validity of the results and their in vivo relevance. The analysis of the mRNA expression of adiponectin stimulated primary human hepatocytes by GeneChip ...
Translation of the abstract (English)
The aim of the current thesis was the identification of adiponectin receptor interacting proteins and adiponectin regulated genes in hepatocytes. Primary human hepatocytes were used for the majority of the experiments, which is crucial for the validity of the results and their in vivo relevance. The analysis of the mRNA expression of adiponectin stimulated primary human hepatocytes by GeneChip experiments revealed that almost 300 genes were regulated by adiponectin.
Until now aldehyde oxidase 1 (AOX1) was mostly investigated in pharmacology and little is known about the regulation of this protein. AOX1 was reduced by adiponectin and fenofibrate via the activation of PPAR-alpha. PPAR-alpha is activated through AdipoR2 by the binding of adiponectin and therefore, AOX1 was most likely reduced through adiponectin via AdipoR2 and PPAR-alpha. AOX1 was found induced in the fatty liver of rats but these data have to be still confirmed in relevant human biopsies. This could reveal new aspects concerning the influence of AOX1 on the metabolism of pharmaceuticals and xenobiotica in fatty livers.
The identification of the transcription factor HNF4-alpha as an adiponectin regulated protein is an important achievement in the completion of the data concerning adiponectin signal transduction. It was shown that adiponectin reduces HNF4-alpha as well as the expression of the HNF4-alpha target genes apoB, ABCB4, GLUT2 and OCT1. The reduced secretion of apoE may be an effect of the lower release of apoB. This diminished secretion of apoB containing hepatic lipoproteins may partly explain the negative association between systemic adiponectin and LDL. Secondary, reduced systemic LDL leads to an elevation of HDL, which is displayed in the positive correlation of adiponectin to HDL.
Furthermore it was demonstrated for the first time that AdipoR1 is expressed in primary human hepatocytes, as well as in hepatocellular cell-lines. In hepatocytes AdipoR1 is reduced at the protein but not the mRNA level by fenofibrate, whereas LXR/RXR agonists and pioglitazone have no impact on AdipoR1. Therefore AdipoR1 seems not to be a direct target gene of these nuclear receptors in hepatocytes.
By the use of in vitro translated and recombinant expressed AdipoR2 protein it was shown that AdipoR2 is a 43 kDa protein, unlike the 35.4 kDa described in the initial publication. The additional 75 N-terminal amino acids of AdipoR2 do not show any homology to AdipoR1, whereas the rest of the amino acid sequences of both proteins have a high similarity.
AdipoR1 abundance was not altered in the liver of rats on a high fat diet, whereas the mRNA expression of AdipoR2 was upregulated. In mice with bile duct ligation induced liver cirrhosis the AdipoR1 and AdipoR2 mRNA expression and the amount of AdipoR1 protein were reduced.
The interaction of SNTA and SNTB2 with the C-termini of both adiponectin receptors is the most interesting result of this thesis. The binding is mediated by the PDZ domain of SNTA and SNTB2 and the PDZ binding motifs identified at the C-termini of AdipoR1 and AdipoR2. It was demonstrated, that the C-termini of both receptors are located intracellularly and the N-termini are extracellular. Incubation with adiponectin stimulated the interaction of SNTB2 and AdipoR1, whereas masking the PDZ binding motif of both receptors led to a complete loss of the interaction. The functional relevance of this interaction was investigated by siRNA experiments. The knockdown of SNTA by specific siRNA led to enhanced AdipoR1 protein levels, whereas the knockdown of SNTB2 resulted in a reduced amount of AdipoR1 protein. The reduction of SNTA and SNTB2 had no impact on adiponectin signalling via AdipoR2. The knockdown of SNTB2 diminished the effects of adiponectin transduced by AdipoR1, whereas the reduction of SNTA tended to improve signalling of adiponectin via AdipoR1. These results suggest an antagonistic effect of SNTA und SNTB2 on the function of AdipoR1.
In order to elucidate the in vivo relevance of this interaction, the livers of SNTA-/-, SNTB2-/- and SNTA/B2-/- knockout mice were investigated in cooperation with Marvin Adams. According to the siRNA experiments the lack of SNTA led to an induction of AdipoR1, whereas the deficiency of SNTB2 resulted in a reduction of AdipoR1. The amount of AdipoR2 protein was not altered in the livers of SNTA-/- mice but was reduced in the livers of SNTB2 mice. In the livers of the SNTA/B2-/- mice reduced AdipoR2 protein was detected whereas AdipoR1 was not altered. A glucose tolerance test revealed that SNTA-/- and SNTB2-/- animals had an impaired glucose tolerance, whereas the SNTA/B2-/- animals displayed a normal glucose tolerance. In addition, the SNTB2-/- mice had an impaired insulin sensitivity. These findings are in accordance with the siRNA experiments. SNTA and SNTB2 have opposite effects on glucose metabolism and the simultaneous deletion of SNTA und SNTB2 seems to compensate these antagonistic effects.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 12:25
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