| License: Publishing license for publications including print on demand (3MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-11369
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.12102
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 22 January 2009 |
| Referee: | Hans Robert (Prof. Dr. Dr.) Kalbitzer |
| Date of exam: | 19 December 2008 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Prof. Dr. Dr. Hans Robert Kalbitzer |
| Keywords: | HIV , Viren , Replikation , Genom , Spacer <Genetik> , Gen nef , Mikrobiologie , Virologie , Offener Leserahmen , Genmutation , p6* , p6pol , Pol , Leseraster , Virusreplikation , Kompetition , p6* , transframe , frameshift , Nef , HIV |
| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 12102 |
Abstract (German)
Auf Grund der Genomorganisation von HIV-1 ist das transframe-Protein p6* Bestandteil des Gag-Pol-Polyproteinvorläufers und liegt dort zwischen dem vom gag-Gen kodierten Nukleocapsid-Protein (NC) und der vom pol-Gen kodierten Protease (PR). P6* selbst wird vom 5´Ende des pol-Gens kodiert. Die Translation zweier Polyproteinvorläufer, Gag und Gag-Pol, wird durch einen -1 ribosomalen ...
Abstract (German)
Auf Grund der Genomorganisation von HIV-1 ist das transframe-Protein p6* Bestandteil des Gag-Pol-Polyproteinvorläufers und liegt dort zwischen dem vom gag-Gen kodierten Nukleocapsid-Protein (NC) und der vom pol-Gen kodierten Protease (PR). P6* selbst wird vom 5´Ende des pol-Gens kodiert. Die Translation zweier Polyproteinvorläufer, Gag und Gag-Pol, wird durch einen -1 ribosomalen Leserastersprung an einer frame shift-Region der RNA ausgelöst. Diese hoch konservierte Region liegt im Kodierungsbereich für den Aminoterminus von p6*. Darüber hinaus ist p6* und die ebenfalls pol-kodierte PR mit p1 und p6gag des gag-Leserasters überlagert.
Abgesehen von seinem Aminoterminus ist auch der Carboxylterminus von p6* hoch konserviert. In unserer Arbeitsgruppe konnte bereits gezeigt werden, dass rekombinant hergestelltes p6* die PR konzentrationsabhängig hemmt. Für diesen Effekt ist hauptsächlich das carboxylterminale Tetrapeptid von p6* verantwortlich. Darüber hinaus stellt es den p6*-Anteil der p6*-PR-Spaltstelle dar, deren Prozessierung für die Freisetzung und vollständige Aktivierung der PR essenziell ist. Mutationen am p6*-Carboxylterminus führten entweder zu einer Verzögerung oder zu einer Blockade der Prozessierung, die im Provirus HX10 unterschiedlich schwere Prozessierungsdefekte hervorriefen. Jedoch konnte für Mutationen, die die Prozessierung verzögerten, bisher kein messbarer Einfluss auf die virale Replikation belegt werden. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde in einem sensitiveren Testsystem gezeigt, dass auch geringere Prozessierungsdefekte für die entsprechenden Virusmutanten zu einem Replikationsnachteil gegenüber dem Wildtyp (Wt) führen.
Um die Rolle der zentralen p6*-Region im Lebenszyklus von HIV-1 in Zusammenhang mit einer postulierten Interaktion von p6* und Nef während der Virusreplikation aufzuklären, wurden in dieser Arbeit sequentielle Mutationen in die kodierende Region von p6* eingeführt. Die Mutationen in der zentralen p6*-Region wählte man so, dass sie die überlagerten p1- und p6gag-Leserahmen unberührt ließen. Als Basis der Mutagenesestudien diente dabei das Nef-kodierende HIV-1-Isolat NL4-3. Es stellte sich heraus, dass die zentrale p6*-Region weder Einfluss auf den Leserastersprung noch auf die Produktion der Polyproteinvorläufer hat. Auch für die Aktivität der PR oder für die Inkorporation von Nef in Viruspartikel spielt sie keine Rolle. Eine Interaktion mit Nef konnte für diesen Bereich von p6* ausgeschlossen werden. Jedoch bewirkte eine Substitution der gesamten zentralen p6*-Region einen Rückgang der viralen Infektiosität und Replikation in vitro.
Mutationen im p6*-Aminoterminus beeinflussen unausweichlich die frame shift-Region oder den überlagerten gag-Leserahmen. Da eine spezifische Mutagenese des p6*-Aminoterminus nicht möglich ist, ohne dabei überlagerte Strukturen zu manipulieren, ist die Rolle dieser Region für die Virusreplikation von HIV-1 noch unbekannt. Daher wurde in dieser Arbeit ein neues HI-Provirus konstruiert, bei dem die frame shift-Region so versetzt wurde, dass die beiden Leserahmen gag und pol entkoppelt vorliegen. Für dieses Virus konnte gezeigt werden, dass die neu generierte frame shift-Region einen funktionellen Leserastersprung auslöst, der zur Translation der Gag und Gag-Pol-Polyproteinvorläufer führt. Deren Prozessierung sowie Infektiosität und Replikationsfähigkeit entsprachen annähernd dem des NL4-3-Isolats. Damit repräsentiert dieses Viruskonstrukt ein neues wertvolles Werkzeug für die Analyse der HIV-1 Replikation. Es erlaubt erstmalig die frame shift-Region p1 und p6gag, sowie p6* und die PR unabhängig voneinander auch durch Deletions- oder Insertions-Mutagenese zu manipulieren.
Mutationsanalysen, mit diesem neuen Virus ergaben, dass auch der p6*-Aminoterminus für die in vitro -Replikation von HIV-1 nicht essenziell ist. Auch die Deletion der gesamten zentralen p6*-Region brachte in vitro keine erkennbaren Nachteile für den Replikationszyklus mit sich. Im Gegenteil, die Virusreplikation wurde sogar beschleunigt. Weiterhin wurde festgestellt, dass Reportergene in den p6*-Leserahmen eingebracht werden können, die die zentrale p6* Region ersetzen. Mit zunehmender Größe schränken diese Insertionen die Funktionalität des Virus jedoch ein. Daher wird vermutet, dass die Aktivität der PR vom Abstand zu ihren aminoterminal gelegenen Spaltstellen im Gag-Pol-Vorläufer abhängt und dass diese Insertionen in den p6*-Leserahmen die Dimerisierung und die Faltung der PR im Gag-Pol-Vorläuferprotein stören.
Diese Arbeit kommt somit zu dem Ergebnis, dass der Carboxylterminus von p6* für die PR-Aktivität und damit für die Replikation des HI-Virus von entscheidender Bedeutung ist. Im Gegensatz dazu ist die Gestalt des Aminoterminus für die Funktionalität des Virus ebenso unerheblich wie die zentrale Region von p6*. Es wird daher angenommen, dass sie die Funktion eines spacers einnimmt, um in vivo dem Virus Raum für escape-Mutationen zu bieten.
Translation of the abstract (English)
The human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) protease (PR) has recently been shown to be inhibited by its propeptide p6* in vitro. P6* also referred to as transframe protein (TFP)-p6pol is located between the nucleocapsid and PR domains in the Gag-Pol polyprotein precursor and is cleaved by the PR during viral maturation. P6* cleavage is absolutely essential to allow complete activation of the ...
Translation of the abstract (English)
The human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) protease (PR) has recently been shown to be inhibited by its propeptide p6* in vitro. P6* also referred to as transframe protein (TFP)-p6pol is located between the nucleocapsid and PR domains in the Gag-Pol polyprotein precursor and is cleaved by the PR during viral maturation. P6* cleavage is absolutely essential to allow complete activation of the PR and subsequent processing of the viral precursors. Lately our laboratory revealed, that mutations in the carboxyl terminal tetrapeptide blocking cleavage between the p6* C- and PR N-terminus yielded noninfectious virions exhibiting severe Gag processing defects. In contrast, mutations retarding hydrolysis of this cleavage site neither seemed to impact viral infectivity and propagation in cultured cells nor seemed to interfere with overall maturation of released viruses. In the present thesis, these mutants were shown to be clearly disadvantaged when challenged with wild-type virus in a dual competition assay.
Apart from its regulatory role of the p6* carboxyl terminus in PR activation, little is known about the function of the residual part of p6* protein in the viral life cycle. Although p6* has been suggested to interact with the viral pathogenicity factor Nef, a potential interaction site in p6* has not been mapped so far. To evaluate effects of p6* modification on viral replication in a Nef positive background, substitutions were introduced into the central p6* region of the infectious provirus NL4-3. Analysis of the p6* mutants in different cell cultures indicated cell type-specific phenotypes which were, however, independent of Nef. Whereas clustered p6* substitutions did not affect particle incorporation of Nef, precursor maturation or viral infectivity, a simultaneous substitution of 40 of the total 56 p6* residues significantly diminished viral replication and infectivity in a Nef-independent manner. Furthermore, this extended modification was not capable of rescuing the negative effects of a transdominant Nef mutant on particle production suggesting that the target for Nef interaction in Gag-Pol is located outside the modified p6* region.
Whereas the central region of p6* can be extensively mutated, mutagenesis of the entire p6* sequence -especially the amino terminal part- in the proviral context is not feasible without affecting the superimposed frameshift signal or the overlapping p1-p6gag domains. To overcome these limitations, a novel NL4-3-derived provirus was created by displacing the original frameshift signal to the 3� end of the gag gene thereby uncoupling the p6* sequence from the p1-p6gag reading frame. The resulting provirus AL proved to be infectious and replication competent in different cell lines. Based on this artificial virus, extensive deletions or substitutions were introduced into the entire p6* reading frame. Surprisingly all these mutations had neutral (substitution) or even positive (deletion) effects on in vitro viral replication. Furthermore, heterologous reporter sequences of different length were expressed from the p6* reading frame and incorporated into virus particles. However, the insertion of the five times larger GFP reporter gene resulted in a clear reduction of virus release due to diminished amounts of particle-associated Pol products and impaired maturation of the viral precursor proteins. These data imply that the length of p6* rather than the sequence context is limiting for p6* function in vitro, suggesting that p6* is a spacer protein.
Beyond the obtained insight in p6*´s role for viral replication, AL is a new valuable tool for further elucidating HIV mechanisms, as it allows for the first time specific and extensive mutagenesis of naturally superimposed domains (p1, p6gag,p6*, PR and the frame shift site) in a replicating virus.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 11:25
Owner only: item control page
Download Statistics