| License: Publishing license for publications excluding print on demand (1MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-9880
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.12128
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 22 June 2009 |
| Referee: | Hans Robert (Prof. Dr. Dr.) Kalbitzer |
| Date of exam: | 28 April 2008 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biophysik und physikalische Biochemie > Prof. Dr. Dr. Hans Robert Kalbitzer |
| Keywords: | Immunmodulation , Immunstimulation , CpG-Inseln , DNS-Sequenz , Genexpression , Gentherapie , Erythropoietin , Expressionsvektor , CpG-Dinukleotide , CpG-Motive , TLR9 , plasmazytoide Dendritische Zellen (pDC) , Interferon alpha , Langzeitexpression , EPO , in vivo Elektroporation , naked DNA , DNA vaccine , gene therapy , plasmid construct , CpG-motifs , pDCs , electro gene transfer , sequence optimisation , hematocrit , EPO |
| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 12128 |
Abstract (German)
Plasmid DNA (pDNA) basierte Vektorsysteme stellen auf Grund ihres hohen Sicherheitspotentials sowie der fehlenden Induktion einer Vektor-spezifischen Immunantwort eine vielversprechende Alternative zu viralen- bzw. Virus-assoziierten Vektorsystemen dar. Trotz dieser Vorteile ist der Einsatz von pDNA-Vektoren sowohl für die genetische Immunisierung als auch in der Gentherapie vor allem durch die ...
Abstract (German)
Plasmid DNA (pDNA) basierte Vektorsysteme stellen auf Grund ihres hohen Sicherheitspotentials sowie der fehlenden Induktion einer Vektor-spezifischen Immunantwort eine vielversprechende Alternative zu viralen- bzw. Virus-assoziierten Vektorsystemen dar. Trotz dieser Vorteile ist der Einsatz von pDNA-Vektoren sowohl für die genetische Immunisierung als auch in der Gentherapie vor allem durch die Notwendigkeit der Verabreichung sehr hoher DNA-Mengen sowie zeitlich begrenzter Transgen-Expression limitiert. Im Hinblick auf das rationale Design von pDNA-Vektoren ist bislang zudem wenig hinsichtlich deren Aktivierung des angeborenen Immunsystems über CpG-Motive im Vektorrückgrat bekannt � im Falle eines Immunisierungsvektors wäre diese Aktivierung von Vorteil, während ein in der Gentherapie eingesetztes Plasmid immunologisch neutral sein sollte.
Im ersten Teil der Arbeit wurde daher der Einfluss des Gehaltes und des Kontextes von CpG-Sequenzen im Vektorrückgrat auf die Aktivierung des angeborenen Immunsystems untersucht. Die Reduktion des CpG-Gehaltes des immunologisch neutralen Ausgangsvektors pRS auf 50,6% (pdeltaS) führte nach Stimulierung naiver Maus-Splenozyten zu einer starken Sekretion proinflammatorischer Cytokine mit einem klaren Th1-Profil. Das erhöhte mitogene Potential des pdeltaS-Vektors ließ sich auch nach Stimulierung humaner plasmazytoider Dendritischer Zellen durch die starke Freisetzung von IFNalpha nachweisen. Die zufällige Deletion eines 110 bp Fragments im pUCori des pdeltaS-Vektors führte zu einem Verlust seiner mitogenen Eigenschaften. Anhand diverser Mutanten konnte gezeigt werden, dass immunstimulatorische Eigenschaften der 110 bp-Region von der Lokalisierung und dem Sequenzkontext der im Fragment enthaltenden CpGs abhängig sind. Durch vergleichende Studien konnte zudem anhand von knockout Mäusen gezeigt werden, dass die immunstimulatorischen Eigenschaften TLR9-abhängig sind. Die Generierung eines mitogenen pDNA-Vektors (pdeltaS) liefert � im Rahmen der Entwicklung eines HIV-Impfstoffes der Arbeitsgruppe � die Grundlage für das Design eines HIV-Impfstoffes der zweiten Generation.
Der Einsatz von pDNA-basierten Vektoren in der Gentherapie setzt eine hohe Expression des eingebrachten Transgens voraus. Im zweiten Teil der Arbeit wurde daher am Beispiel von murinem Erythropoietin (mEPO) der Einfluss des Gehaltes an intragenischen CpG-Sequenzen sowie von Kodonvariationen auf die in vitro und in vivo Expression eines Transgens evaluiert. Die Eliminierung aller intragenen CpGs resultierte in einer verminderten in vitro Expression, die Kodon-Optimierung sowie die Erhöhung des CpG-Gehaltes hingegen in einer Expressionssteigerung. Das unterschiedliche Expressionsmuster der mEPO-Genvarianten war bereits auf mRNA-Ebene ausgeprägt und ist kein Resultat unterschiedlicher Translationseffizienzen. In vivo konnte in Balb/c Mäusen im Falle Kodon-optimierter und CpG-modifizierter Gene über einen Zeitraum von über einem Jahr eine stark erhöhte mEPO-Expression gezeigt werden. Nach in vivo Elektroporation der modifizierten mEPO-Gene war zudem bereits bei niedrigen pDNA-Dosen eine dauerhafte und signifikante Erhöhung der von mEPO regulierten Hämatokrit- und Hämoglobin-Werte nachweisbar, ohne dass dabei Nebenwirkungen beobachtet werden konnten.
Die Daten zeigen, dass durch CpG-Sequenzmodifizierungen im pDNA-Vektorrückgrat gezielt Einfluss auf die Induktion des angeborenen Immunsystems genommen werden kann. Zudem haben, wie am Beispiel von mEPO gezeigt, die Erhöhung des intragenischen CpG-Gehaltes sowie Kodon-Optimierungen eine stark erhöhte Expression und somit auch Wirksamkeit eines therapeutisch eingesetzten Gens zur Folge.
Translation of the abstract (English)
Among the prevalent vector systems being developed for in vivo applications such as vaccination or gene therapy, plasmid DNA (pDNA)-based approaches provide some crucial advantages over viral vectors regarding safety concerns and lack of toxicity or pathogenicity. However, the use of pDNA for genetic vaccines or in gene therapy is limited owing to poor transfection efficiencies in vivo. To ...
Translation of the abstract (English)
Among the prevalent vector systems being developed for in vivo applications such as vaccination or gene therapy, plasmid DNA (pDNA)-based approaches provide some crucial advantages over viral vectors regarding safety concerns and lack of toxicity or pathogenicity. However, the use of pDNA for genetic vaccines or in gene therapy is limited owing to poor transfection efficiencies in vivo. To overcome the relative inefficiency of pDNA-based vaccines or gene transfer either large amounts of pDNA or multiple injections are currently needed. Moreover, mechanisms triggering the activation of the innate immune system via CpG-motifs in the vector backbone are poorly understood. Whereas the activation of the innate immune system is a desired attribute of DNA-vaccine vectors, pDNA-based vectors used in gene therapy should be rather immunologically neutral.
In the first part of this work the influence of CpG-specific modifications in the vector backbone, on the activation of the innate immune system was investigated ex vivo in a murine splenocyte model and on human plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In contrast to pRS-vector (100% CpGs), pdeltaS-DNA (50.6% CpGs) induced the secretion of high amounts of IFNgamma; and IL-6 as demonstrated by ELISPOT analyses and quantification of secreted cytokines indicating a strong Th1-polarisation. These data indicate a balance shift between immune stimulatory- and inhibitory CpG-motifs following reduction of the overall CpG-amounts resulting in the generation of the immune potent pdeltaS-vector. Whereas pdeltaS-DNA-stimulated splenocytes from wildtype mice produced high amounts of IFNgamma and IL-12, this effect was totally aborted in TLR9-/- mice showing dependency on the expression of TLR9. Additionally, in vitro stimulations of human pDCs with pdeltaS-DNA resulted in a secretion of high amounts of type I interferon (IFNalpha). In conclusion, the herein presented results suggest that an activation of the innate immune system can be achieved by CpG-specific modifications within the pDNA-vector backbone.
Using pDNA for gene therapy approaches requires a critical improvement of transgene expression efficiency and sustained long-term in vivo expression with low amounts of pDNA. Thus, in the second part of this work the influence of the intragenic CpG amount and codon optimisation of murine erythropoietin (mEPO) on the in vitro and long-time in vivo protein expression were tested.
In vitro, both the optimisation of codon usage as well as intragenic CpG enrichment independently resulted in a significantly elevated transient mEPO expression in human and murine cells, whereas the removal of CpG dinucleotides from the coding region rather reduced expression levels in vitro. A more in-depth analysis of the molecular backgrounds underlying differential expression of the various mEPO genes revealed that both sequence modifications augmented the overall mEPO-specific mRNA amounts in established cell lines correlating with increased de novo transcription rates, whereas CpG depletion rather diminished specific transcript amounts.
Electro gene transfer (EGT) of codon-optimised and CpG-enriched mEPO genes into Balb/c mice resulted in significantly increased in vivo expression efficiencies for more than 12 months compared with the non-optimised variants. Additionally, after transfer of low amounts of pDNA increased levels and duration of mEPO expression were observed which resulted in significantly elevated hematocrit and haemoglobin levels in treated mice, without causing toxic side effects. In summary, using mEPO as reporter gene, the optimisation of sequence-specific parameters, such as codon usage and CpG-content, combined with an efficient gene transfer can significantly increase the level and duration of transgene expression in vivo thereby lowering the threshold of effective pDNA amounts.
Taken together the herein presented results provide evidence that sequence-specific optimisations represent a potent tool for improvement of pDNA-based vectors for genetic immunisation and gene therapy approaches.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 11:21
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