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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-10519
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.12136
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 11 November 2009 |
| Referee: | Stephan (Prof. Dr.) Schneuwly |
| Date of exam: | 30 July 2008 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Zoologie > Entwicklungsbiologie (Prof. Dr. Stephan Schneuwly) |
| Keywords: | Taufliege , Ras-Proteine , Nervendegeneration , Signaltransduktion , Autophagie <Physiologie> , Proteinkinase B , Altern , Apoptosis , Genexpression , vap , Protein/Protein Interaktion , Crk , carnation , Apoptose , vap , protein/protein interaction , Crk , carnation , apoptosis |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 590 Zoological sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 12136 |
Abstract (German)
Mutationen im RasGAP Gen der Taufliege Drosophila melanogaster verursachen, neben anderen Phänotypen wie Verkürzung der Lebensspanne und Verhaltensstörungen, altersabhängige Neurodegeneration. Wie eine funktionelle Analyse ergab, ist für die Entstehung dieses vap (vacuolar peduncle) Phänotyps der N-terminale Teil des in den Fliegen betroffenen RasGAP Proteins von besonderer Bedeutung. In diesem ...
Abstract (German)
Mutationen im RasGAP Gen der Taufliege Drosophila melanogaster verursachen, neben anderen Phänotypen wie Verkürzung der Lebensspanne und Verhaltensstörungen, altersabhängige Neurodegeneration. Wie eine funktionelle Analyse ergab, ist für die Entstehung dieses vap (vacuolar peduncle) Phänotyps der N-terminale Teil des in den Fliegen betroffenen RasGAP Proteins von besonderer Bedeutung. In diesem Teil von RasGAP sind für Protein/Protein Interaktionen zuständige Domänen zu finden, was eine Bedeutung solcher Interaktionen für die korrekte Funktion von RasGAP in den Neuronen nahelegt.
Zur Identifizierung von Interaktionspartnern von RasGAP aus adulten Köpfen von Drosophila melanogaster wurde im Rahmen der vorliegenden Dissertation ein Yeast Two Hybrid Screen durchgeführt; es konnten jedoch keine Interaktionspartner identifiziert werden. Dies kann zum einen durch methodische Probleme wie eine möglicherweise aufgrund mehrerer Amplifikationsschritte nicht mehr vollständig repräsentative Bibliothek oder generelle Schwierigkeiten der Detektion schwacher Interaktionen mit dem verwendeten System begründet werden. Zum anderen findet der Großteil der bisher identifizierten, und damit möglicherweise überhaupt aller, Interaktionen von RasGAP über seine SH2 Domänen statt; solche Phosphorylierungs-abhängigen Interaktionen können mit dem verwendeten System jedoch grundsätzlich nicht detektiert werden.
Ein bekannter Interaktionspartner der SH2 Domänen von RasGAP ist der Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR). Ebenfalls bekannt ist eine quantitative Konkurrenz um Bindestellen in diesem Rezeptor von RasGAP mit dem Adapter-Protein Crk. Um Auswirkungen der Störung des Gleichgewichts der Bindung dieser beiden Proteine zu untersuchen, wurden zur Beeinflussung der Gendosis von Crk UAS-Crk und UAS-Crk-RNAi Fliegenlinien hergestellt. Die Funktionalität der Konstrukte konnte gezeigt werden. Die Ergebnisse der durchgeführten Experimente zur Beeinflussung der Expression in Neuronen lassen jedoch keine eindeutige Aussage zu einer genetischen Interaktion von RasGAP mit Crk in Bezug auf den Neurodegenerations-Phänotyp zu.
Eine weitere denkbare Erklärung für den Tod von Neuronen in vap Fliegen wäre das Fehlen des möglicherweise als genereller Überlebensfaktor benötigten N-terminalen Teils von RasGAP. Um das zu untersuchen, wurde ein Modellsystem entwickelt, mit dem in Drosophila melanogaster Apoptose induziert und eine eventuelle Rettung durch Expression bestimmter Faktoren beobachtet werden kann. Expression des N-terminalen Teils von Drosophila melanogaster RasGAP konnte jedoch den induzierten Zelltod nicht verhindern, was gegen eine Rolle als genereller Überlebensfaktor spricht. Insgesamt ist ein Zusammenhang der vap Mutation mit apoptotischen Vorgängen unwahrscheinlich. Hingegen sprechen verschiedene Hinweise für eine Rolle der Autophagie.
Die Ergebnisse der Untersuchung genetischer Interaktionen deuten auf einen möglichen Einfluss verschiedener Elemente des PI3K/Akt/TOR Signalweges, welcher für die Regulation der Autophagie wichtig ist, auf den Neurodegenerations-Phänotyp in vap Mutanten hin.
Zudem konnte eine genetische Interaktion von vap1 mit der car1 Mutation, der eine Bedeutung bei der Vesikelverschmelzung im Laufe der Autophagie zugeschrieben wird, in Bezug auf die Lebensspanne der Tiere sowie auf den Neurodegenerations-Phänotyp nachgewiesen werden. Außerdem zeigte sich ein Einfluss der car1 Mutation auf das Auftreten autophagischer Vesikel in den Neuronen von vap Fliegen.
Insgesamt kann aufgrund der Ergebnisse aus den beiden zuletzt beschriebenen Teilen der vorliegenden Arbeit sowie weiterer im Anschluss daran am Lehrstuhl durchgeführter Versuche und verschiedener Hinweise aus der Literatur eine Beteiligung autophagischer Prozesse an der Entstehung des Neurodegenerations-Phänotyps in Drosophila melanogaster vap Mutanten angenommen werden. Vermutlich haben verschiedene der zahlreichen Interaktionen von RasGAP in unterschiedlichen Signaltransduktionswegen einen Einfluss auf die Regulation dieser Vorgänge.
Translation of the abstract (English)
Mutations in the Drosophila melanogaster RasGAP gene cause, in addition to phenotypes like shortening of the lifespan and behavioural deficits, age-dependent neurodegeneration in the fruit fly. As a functional analysis showed, the N-terminal part of the affected RasGAP protein is crucial for the development of this vap (vacuolar peduncle) phenotype. This part of RasGAP contains domains ...
Translation of the abstract (English)
Mutations in the Drosophila melanogaster RasGAP gene cause, in addition to phenotypes like shortening of the lifespan and behavioural deficits, age-dependent neurodegeneration in the fruit fly. As a functional analysis showed, the N-terminal part of the affected RasGAP protein is crucial for the development of this vap (vacuolar peduncle) phenotype. This part of RasGAP contains domains responsible for protein/protein interactions, suggesting a role of such interactions for the correct function of RasGAP in neurons.
In order to identify interaction partners of RasGAP from Drosophila melanogaster adult heads, a yeast two hybrid screen was conducted in the course of the present dissertation; no interaction partners could be identified. This result could originate from methodical problems like a library not entirely representative any more because of several amplification steps or from a difficulty in identifying weak interactions with the used system. Another reason could be that the main part of the interactions characterised so far, and thus, possibly of all interactions, of RasGAP takes part through its SH2 domains; such phosphorylation-dependent interactions can generally not be detected with the used system.
A well-known interaction partner of RasGAP�s SH2 domains is the Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR). A quantitative competition for binding sites on this receptor between RasGAP and the adaptor protein Crk is also known. To analyse the consequences of a disturbance of the balance in the binding of this two proteins, UAS-Crk and UAS-Crk-RNAi fly strains were made to facilitate manipulation of the gene dose of Crk. Functionality of the constructs could be shown; the results of the experiments do not allow for an unequivocal conclusion about a genetic interaction of RasGAP with Crk in the context of the neurodegeneration phenotype.
Another possible explanation for the death of neurons in vap flies could be lack of the N-terminal part of RasGAP, which could have a role as a general survival factor. To analyse this, a model system was developed to induce apoptosis in Drosophila melanogaster and to monitor eventual rescue through expression of special factors. Expression of the N-terminal part of Drosophila melanogaster RasGAP could not inhibit the induced cell death, which argues against a role as a general survival factor. Overall, a relation of the vap mutation with apoptotic processes seems improbable. However, several clues argue for a role of autophagy.
The results of an analysis of genetic interactions point at a possible influence of diverse elements of the PI3K/Akt/TOR signalling pathway, which is important for the regulation of autophagy, on the neurodegeneration phenotype in vap mutants.
Additionally, a genetic interaction between vap1 and the car1 mutation, which is assigned a role in the vesicle fusion during autophagy, could be shown regarding the life span of the animals as well as regarding the neurodegeneration phenotype. Furthermore, an influence of the car1 mutation on the incidence of autophagic vesicles in the neurons of vap flies could be shown.
Altogether, based on the results of the described last two parts of this work as well as on the results of further experiments conducted at the institute and additional hints from the literature, an influence of autophagic processes on the development of the neurodegeneration phenotype in Drosophila melanogaster vap mutants can be assumed. Probably, several of the numerous interactions of RasGAP in diverse signal transduction pathways have an influence on the regulation of these processes.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 11:20
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