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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-11521
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Date: | 15 March 2009 |
| Referee: | Widmar (Prof. Dr.) Tanner |
| Date of exam: | 13 November 2008 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Pflanzenwissenschaften > Lehrstuhl für Zellbiologie und Pflanzenphysiologie (Prof. Dr. Klaus Grasser) |
| Keywords: | Plasmamembran , Saccharomyces cerevisiae , Konfokale Mikroskopie , Membrantransport , Membranpotenzial , Kompartimentierung , Membranproteine , Lipide , MCC , MCP , Eisosomen , Mikrodomänen , GFP , membrane microdomains , MCC , MCP , eisosomes , membrane potential |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 12235 |
Abstract (English)
In the plasma membrane of cells the complex variety of components is sorted into subcompartments, microdomains and nanoclusters. We only begin to understand the principles of this higher order. The heterogeneity of these subunits creates individual microenvironments for various membrane linked processes like substrate transport, signal perception and transduction, or interaction between cells. ...
Abstract (English)
In the plasma membrane of cells the complex variety of components is sorted into subcompartments, microdomains and nanoclusters. We only begin to understand the principles of this higher order. The heterogeneity of these subunits creates individual microenvironments for various membrane linked processes like substrate transport, signal perception and transduction, or interaction between cells. The yeast Saccharomyces cerevisiae is a particularly suitable model organism to investigate plasma membrane compartmentation. In addition to homogenously distributed membrane proteins, two non-overlapping, stable and immobile distribution patterns exist, which can be resolved by light microscopy. This work focuses on composition, formation and stabilization of the spotty membrane compartment of the arginine permease Can1 (MCC) and provides evidence for the biological significance of protein segregation within the plasma membrane.
In adult mother cells, MCC forms 40 to 60 patchy domains that can be studied by tagging MCC protein constituents with fluorescent proteins. In addition to the known members Can1, the protein of unknown function Sur7 and the uracil permease Fur4, eleven further proteins could be localized. From published localization data of other groups additional MCC located proteins could be identified, raising the total number to 21 proteins within or associated with this membrane compartment. Only nine of these proteins are transmembrane proteins, while the other twelve are attached to MCC on the cytosolic side of the plasma membrane. Not only proteins, but also membrane lipids follow this compart-mentation. By the finding that Filipin-stained sterols accumulate within MCC as well, an inhomogeneous distribution of lipids in non-polarized cells could be demonstrated for the first time. Consistently, the tryptophan transporter Tat2 was also localized within MCC when tagged with green fluorescent protein (GFP). For Tat2, a dependence of ergosterol for correct targeting to the plasma membrane had been shown previously. In contrast to the local accumulation of Tat2-GFP, the tagged amino acid permease Gap1-GFP was equally distributed in the plasma membrane under all tested conditions. Gap1 differs from Tat2 in its dependence on sphingolipids for correct conformation, transport activity and stability in the membrane.
According to the potentially lipid-mediated sorting of Tat2, also the ergosterol-binding hexose/H+-symporter HUP1 from Chlorella kessleri could be localized within MCC after tagging with GFP and heterologous expression in S. cerevisiae. A detailed analysis of the association of HUP1-GFP with MCC unveiled a high dependence of the patchy distribution on the energization of the plasma membrane, which could be confirmed for all MCC located H+-symporters. As soon as the membrane potential is uncoupled by an ionophor or an electrical pulse, the transporters dissipate from the compartment. Upon repolarization the transporters again accumulate within MCC. However, this behavior was only observed for H+-symporters, while no movement was detectable for other transmembrane or associated proteins. Nevertheless, this finding demonstrates a previously unknown function of the membrane potential in the lateral organization of the plasma membrane.
In addition to this physical parameter 28 genes could be identified, that are necessary for a correct MCC formation. Using HUP1-GFP as a marker protein a genome-wide, visual screen was performed, addressing all viable single-deletion mutants. Among the identified genes those were significantly overrepresented that affect lipid metabolism (especially ergosterol biosynthesis) or vesicle-mediated transport. By testing the distribution of further MCC marker proteins as well as filipin-stained sterols a group of six most severely affected mutants could be identified, including the deletion strains nce102Δ and pil1Δ. Both proteins, Nce102 and Pil1, colocalize with MCC and therefore are regulators of domain formation in situ. While Nce102 is an integral membrane protein of unknown function, the soluble Pil1 is one of the main components of eisosomes. This novel structure beneath MCC is suggested to mark sites of active endocytosis. However, own localization studies using the GFP-tagged endocytic markers Rvs161, Ede1 and Sla2 revealed a clear separation of MCC and sites of active endocytosis. Mutant analyses showed that the lack of Pil1 or Nce102 rather accelerates the substrate-induced degradation of the MCC protein Can1. Prior to internalization Can1 leaves MCC which presumably makes it available for enzymes of the endocytic machinery. In both mutants Can1 is equally distributed from the beginning, thereby shortening the initial steps of internalization. Thus, MCC forms a protective �shelter� within the plasma membrane to regulate the turnover of membrane proteins.
Translation of the abstract (German)
In der Vielfalt von Komponenten der Plasmamembran existiert eine höhere Ordnung aus Subkompartimenten, Mikrodomänen und Nanoclustern, deren Prinzipien wir erst allmählich beginnen zu verstehen. Die Heterogenität solcher Untereinheiten erlaubt die Schaffung von individuellen Milieus für verschiedenste Membrangebundene Prozesse wie Transportvorgänge, Reizweiterleitung und Zell-Zell-Interaktionen. ...
Translation of the abstract (German)
In der Vielfalt von Komponenten der Plasmamembran existiert eine höhere Ordnung aus Subkompartimenten, Mikrodomänen und Nanoclustern, deren Prinzipien wir erst allmählich beginnen zu verstehen. Die Heterogenität solcher Untereinheiten erlaubt die Schaffung von individuellen Milieus für verschiedenste Membrangebundene Prozesse wie Transportvorgänge, Reizweiterleitung und Zell-Zell-Interaktionen. Um Membrankompartimentierung zu untersuchen, eignet sich besonders die Hefe Saccharomyces cerevisiae als Modellorganismus. Hier existieren neben gleichmäßig verteilten Proteinen auch zwei nicht einander überlappende, stabile und unbewegliche Proteinverteilungsmuster, die sich lichtmikroskopisch auflösen lassen. Diese Arbeit konzentriert sich auf die Zusammensetzung, Entstehung und Stabilisierung des nach dem ersten in ihm identifizierten Protein benannten Membrankompartiment der Argininpermease Can1 (MCC) und bietet Hinweise für die biologische Bedeutung dieser Unterteilung der Plasmamembran.
In adulten Mutterzellen bildet MCC 40 bis 60 fleckige Domänen in denen neben Can1, dem Protein unbekannter Funktion Sur7 und der Uracilpermease Fur4 elf weitere Proteine lokalisiert werden konnten. Durch Übereinstimmungen mit veröffentlichten Lokalisationsdaten anderer Gruppen steigt die Anzahl der colokalisierenden Proteine auf 21, wobei nur neun davon Transmembranproteine darstellen. Die übrigen zwölf sind offenbar auf der zytosolischen Seite mit MCC assoziiert. Jedoch nicht nur Proteine sondern auch Membranlipide folgen dieser Kompartimentierung. Filipingefärbte Sterole sind ebenfalls im MCC akkumuliert, wodurch erstmals eine ungleichmäßige Lipidverteilung in nichtpolarisierten Zellen mikroskopisch nachgewiesen werden konnte. Passenderweise findet sich unter den MCC-ständigen Proteinen auch der Tryptophantransporter Tat2, für dessen Targeting zur Plasmamembran eine Abhängigkeit von Ergosterol bereits nachgewiesen worden war.
Entsprechend der möglicherweise lipidvermittelten Sortierung von Tat2 konnte zusätzlich auch der nachweislich Ergosterolbindende Hexose/H+ Symporter HUP1 aus Chlorella kessleri nach heterologer Expression im MCC lokalisiert werden. In der Spalthefe Schizosaccharomyces pombe wurde die bevorzugte Anhäufung von HUP1 in sterolreichen Membrankompartimenten ebenfalls beobachtet. Eine eingehende Analyse der MCCAssoziierung von HUP1GFP offenbarte eine Abhängigkeit der fleckigen Verteilung von der Energetisierung der Plasmamembran, die sich für alle im MCC befindlichen H+Symporter bestätigen ließ. Sobald das Membranpotential der Zellen durch ein Ionophor oder einen elektrischen Puls entkoppelt wird, verteilen sich die Transporter gleichmäßig über die Membran. Eine Repolarisierung der Membran führt zu erneuter Akkumulation innerhalb von MCC. Dieses Verhalten konnte nur bei H+Symportern, nicht jedoch bei den übrigen Transmembran- oder assoziierten Proteinen festgestellt werden. Dennoch zeigt sich damit eine bisher unbekannte Bedeutung des Membranpotentials in der Organisation der Plasmamembran.
Neben diesem physikalischen Parameter wurden in einem genomweiten, Mikroskopie-basierten Screen unter sämtlichen lebensfähigen und mit dem Marker HUP1GFP transformierten Einzeldeletionsmutanten 28 Gene identifiziert, die für eine korrekte MCC-Bildung von Bedeutung sind. Unter allen Mutanten waren vor allem solche überrepräsentiert, die Mutationen in Lipidstoffwechselwegen oder Vesikeltransportmechanismen tragen. Nach Überprüfung der Verteilung weiterer MCC-Markerproteine sowie filipingefärbter Sterole wurden unter den am stärksten betroffenen Mutanten nce102Δ und pil1Δ identifiziert, die näher charakterisiert wurden. Beide Proteine, Nce102 und Pil1, colokalisieren mit MCC und beeinflussen damit die Domänenbildung vor Ort. Während Nce102 ein integrales Membranprotein mit noch unbekannter Funktion ist, bildet das lösliche Pil1 eine der Hauptkomponenten der Eisosomen, einer neuartigen Struktur unterhalb von MCC, die mit Orten aktiver Endozytose in Verbindung gebracht wird. Eigene Lokalisationsstudien mit den Endozytose-Markern Rvs161, Ede1 und Sla2 ergaben jedoch eine deutliche räumliche Trennung von MCC und Orten aktiver Endozytose. Mutantenanalysen ergaben, dass das Fehlen entweder von Pil1 oder von Nce102 den substratinduzierten Abbau des MCC proteins Can1 sogar beschleunigt. Can1 wandert dabei in Wildtyp-Zellen vor der Internalisierung aus dem MCC aus und wird vermutlich erst damit für die Enzyme der Endozytosemaschinerie zugänglich. In den beiden Mutanten ist Can1 jedoch bereits gleichmäßig verteilt, wodurch der initiale Schritt der Internalisierung abgekürzt wird. MCC bildet daher eine �Schutzzone� zur Regulation des Turnovers von Membranproteinen.
Metadata last modified: 03 Jun 2018 21:14
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