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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-12229
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.12263
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Date: | 22 April 2009 |
| Referee: | Gerd (Prof. Dr.) Schmitz |
| Date of exam: | 24 March 2009 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Klinische Chemie und Laboratoriumsmedizin |
| Keywords: | Monozyt , Gerinnungsfaktor III , FC-Rezeptor , Blutgerinnung , Sepsis , Immunsystem , Zellfraktionierung , Arteriosklerose , Koagulation , Autoimmunerkrankung , CD16 , CD32 , CD64 , Subpopulation , monocyte , Fc receptor , Tissue Factor , CD16 , subpopulation |
| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 12263 |
Abstract (German)
HINTERGRUND: Monozyten [Mo.] stehen gewissermaßen an der Schnittstelle zwischen Immunsystem und Gerinnungssystem, da sie einerseits die Fc- bzw. Fc gamma-Rezeptoren [FcgR] besitzen, denen eine Schlüsselstellung innerhalb des Immunsystems zufällt andererseits den für die Initiierung und die Ausbreitung (�propagation�) der Thrombinbildung entscheidenden Tissue Factor [TF] liefern können. Eine ...
Abstract (German)
HINTERGRUND:
Monozyten [Mo.] stehen gewissermaßen an der Schnittstelle zwischen Immunsystem und Gerinnungssystem, da sie einerseits die Fc- bzw. Fc gamma-Rezeptoren [FcgR] besitzen, denen eine Schlüsselstellung innerhalb des Immunsystems zufällt andererseits den für die Initiierung und die Ausbreitung (�propagation�) der Thrombinbildung entscheidenden Tissue Factor [TF] liefern können.
Eine direkte Stimulierbarkeit von Mo. zur Expression von prokoagulanter Aktivität [PCA] bzw. TF durch FcgR-Aktivierung wird in der Literatur kontrovers diskutiert, wobei entsprechende Arbeiten mit selektivem Crosslinking einer monozytären FcgR-Klasse (FcgRI [CD64], FcgRIIA/B [CD32], FcgRIIIA [CD16]) nicht gefunden wurden. Obwohl TF der Initiator der Gerinnungskaskade in vivo ist, können messbare TF-Expression und PCA in verschiedenen Situationen deutlich voneinander abweichen, was zunehmend intensiv untersucht wird (sog. �TF encryption/de-encryption�). Die am häufigsten von der stark CD14-positiven Mo.-Hauptpopulation abgegrenzte Subpopulation [SP] CD14(+)CD16(+) scheint bei verschiedenen Erkrankungen, wie z. B. der Lipopolysaccharid (LPS)-induzierten Sepsis eine wesentliche Rolle zu spielen.
Grundlegende Ziele der Arbeit waren deshalb die Untersuchung von Zusammenhängen zwischen den drei verschiedenen FcgR-Klassen und PCA am Mo., die Betrachtung der Korrelation der erzeugten PCA mit ihrem Hauptinitiator TF sowie die Ermittlung von Beziehungen zwischen CD16-Expression und TF-Induktion bzw. -Induzierbarkeit unter LPS-Stimulation.
METHODEN:
Mo. wurden aus Buffy-Coat-Präparaten konventioneller Blutspenden durch Dichtegradientenzentrifugation und anschließender Positiv- oder Negativisolierung mit Magnetbeads gewonnen. Die TF-/PCA-Induktion nach selektiver Stimulation einer FcgR-Klasse mit spezifischen F(ab�)2-Fragementen bzw. Antikörpern wurde an isolierten Mo. auf verschiedenen Ebenen untersucht (Calcium-Influx, TF-mRNA, TF-Gesamtprotein, TF-Oberflächenexpression [OE], PCA mittels Rekalzifizierungszeit-Assay). Zur Messung der revers transkribierten TF-mRNA (= TF-cDNA) wurde eine Real-Time-PCR etabliert, die die absolute Quantifizierung der TF-cDNA erlaubte. Mit den Inkubationen wurden Korrelationsuntersuchungen zwischen TF-OE und PCA durchgeführt, z. T. mit Einsatz eines blockierenden Anti-TF-Antikörpers. Auswirkungen der LPS-Stimulation auf die CD16-OE, sowie Effekte der CD16-OE auf die LPS-induzierte PCA wurden an negativisolierten Mo. und in Vollblutproben freiwilliger Blutspender untersucht. Die Etablierung einer Magnetbead-vermittelten Anreicherung der CD16(+)- und CD16(-)-SP erlaubte schließlich den Vergleich der LPS-induzierten PCA in beiden SP.
ERGEBNISSE UND DISKUSSION:
Es wurde gezeigt, dass in Mo.-Isolaten durch selektives Crosslinking des FcgRI TF bzw. PCA induziert werden kann, während dies für ein FcgRIIIA-Crosslinking nicht möglich war und der FcgRII (Subklassen: aktivierender FcgRIIA und inhibierender FcgRIIB) diesbezüglich variable Effekte erbrachte. Für die Induktion von monozytärem TF und damit die Initiierung der Gerinnungskaskade erscheint dabei das alleinige Crosslinking (ohne Fc-Ligierung) der FcgR ausreichend. Die hier überraschend gute Korrelation zwischen monozytärer TF-OE und PCA-Induktion kann ein Hinweis für eine bei diesen Experimenten nur wenig relevante TF encryption/de-encryption sein oder für eine weitgehende Spezifität des verwendeten fluoreszenzmarkierten Anti-TF-Antikörpers für aktiven (de-encrypted) TF. Die hohe Relevanz von TF bei der PCA-Induktion wurde durch eine um 95 % liegende Blockierbarkeit der PCA durch einen Anti-TF-Antikörper verdeutlicht. Eine residuale PCA (hier um 5 %) nach TF-Blockade zeigt sich auch in anderen Arbeiten, ihre Herkunft ist aber nicht eindeutig geklärt. Unter LPS-Stimulation resultierte eine Abnahme der CD16(+)-SP sowie eine höhere TF-OE auf den CD16(-)-Mo. im Vergleich zu den CD16(+)-Mo. Diese negative Korrelation von CD16- und TF-OE (bzw. CD16-OE und PCA-Induktion durch LPS) bestätigte sich auch mit getrennt untersuchten, angereicherten CD16(+)-/CD16(-)-SP, wo die CD16(-)-Fraktion im Mittel die höhere PCA-Antwort lieferte.
SCHLUSSFOLGERUNGEN:
Die Ergebnisse prägen am Monozyten ein Bild vom FcgRIIIA als Negativindikator für PCA/PCA-Induzierbarkeit und vom FcgRI als entsprechendem Positivindikator bzw. direktem PCA-Trigger. Effektvariabilitäten beim FcgRII stehen wahrscheinlich im Zusammenhang mit der Wechselwirkung des eingesetzten F(ab�)2-Fragments mit den beiden Subklassen des FcgRII (aktivierender FcgRIIA und inhibierender FcgRIIB). Monozytärer oberflächenassoziierter TF konnte dabei als wesentlicher PCA-Induktor ausgemacht werden und zeigte hier gute Korrelationen mit der PCA-Antwort, was für das intensiv beforschte Feld der TF encryption/de-encryption von Bedeutung ist. SP-Anreicherung und (Sub)Klassen-spezifisches FcgR-Crosslinking sind wichtig zur genauen Bewertung der betrachteten Effekte.
Translation of the abstract (English)
BACKGROUND: Monocytes represent an important link between immune and coagulation system, on the one hand expressing Fc receptors resp. Fc gamma receptors [FcgR] playing a key role in the immune system on the other hand providing tissue factor [TF], critical for initiation and propagation of thrombin formation. A direct inducibility of procoagulant activity [PCA] resp. TF in monocytes by ...
Translation of the abstract (English)
BACKGROUND:
Monocytes represent an important link between immune and coagulation system, on the one hand expressing Fc receptors resp. Fc gamma receptors [FcgR] playing a key role in the immune system on the other hand providing tissue factor [TF], critical for initiation and propagation of thrombin formation.
A direct inducibility of procoagulant activity [PCA] resp. TF in monocytes by activation of FcgRs is discussed controversial in literature and corresponding work with selective crosslinking of a monocytic FcgR class (FcgRI [CD64], FcgRIIa/b [CD32], FcgRIIIa [CD16]) wasn�t found. Though TF represents the main activator of the blood coagulation cascade in vivo measurable TF expression and PCA may differ strongly in certain situations which is being investigated increasingly (so-called TF encryption/de-encryption). The most often defined monocyte subpopulation CD14(+)CD16(+) besides the strong CD14 positive main population of monocytes seems to play a crucial role in several diseases, e. g. lipopolysaccharide [LPS] induced sepsis.
Therefore fundamental aims of this work were the investigation of links between the three different FcgR classes and PCA in monocytes, the observation of correlation of induced PCA with its main trigger TF and the determination of relations between CD16 expression and TF induction resp. TF inducibility through LPS stimulation.
METHODS:
Monocytes were obtained from buffy coat preparations of normal blood donations by density gradient centrifugation and subsequent positive or negative isolation with magnetic beads. TF/PCA induction after selective stimulation of one FcgR class with specific F(ab�)2 fragments resp. antibodies was investigated in isolated monocytes at different levels (calcium influx, TF-mRNA, total TF protein, TF surface expression [SE], PCA by an recalcification time assay). For measurement of reverse transcribed TF-mRNA (= TF-cDNA) a real time PCR was established allowing absolute quantification of TF-cDNA. With these incubations correlation tests between TF SE and PCA were done, in part with application of a blocking anti TF antibody. Effects of LPS stimulation on CD16 SE as well as effects of CD16 SE on LPS induced PCA were investigated in negatively isolated monocytes and in whole blood from voluntary blood donators. Establishing an enrichment of CD16(+) and CD16(-) subpopulations with magnetic beads finally permitted a comparison of LPS induced PCA in both subpopulations.
RESULTS AND DISCUSSION:
It was shown that TF resp. PCA can be induced in monocyte isolates through selective crosslinking of FcgRI, whereas this wasn�t possible through FcgRIIIa crosslinking and FcgRII (subclasses: activating FcgRIIa and inhibiting FcgRIIb) showed variable effects relating to this. For induction of monocyte TF and thereby for initiation of blood coagulation cascade sole crosslinking (without Fc ligation) of FcgR seems to be sufficient. The surprisingly good correlation between monocyte TF SE and PCA induction can be a hint for TF encryption/de-encryption possessing little relevance in these experiments or for the utilized antibody having an extensive specificity for active (de-encrypted) TF. The key role of TF in PCA induction was illustrated by an anti TF antibody blocking around 95 % of PCA. A residual PCA (around 5 %) after blocking of TF can also be found in other publications, but its origin isn�t clarified definitely. Monocyte stimulation with LPS resulted in a decrease of the CD16(+) subpopulation as well as in a higher TF SE on the CD16(-) monocytes compared to the CD16(+) monocytes. This negative correlation of CD16 SE and TF SE (resp. CD16 SE and PCA induction by LPS) was also confirmed with separately investigated, enriched CD16(+)/CD16(-) subpopulations with the CD16(-) fraction showing the higher average PCA response.
CONCLUSION:
The results implicate a view of FcgRIIIa as a negative indicator for PCA/PCA inducibility and of FcgRI as a positive indicator resp. a direct trigger for PCA in this context. Variations of FgcRII stimulation effects are probably associated with interactions of the utilized F(ab�)2 fragments with both subclasses of FcgRII (activating FcgRIIa and inhibiting FcgRIIb). Thereby monocytic surface associated TF was found to be the essential PCA inductor and showed good correlations with the PCA response in this work what is important concerning the intensely investigated field of TF encryption/de-encryption. Enrichment of subpopulations and (sub)class specific FcgR crosslinking are important for the exact evaluation of the observed effects.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 11:07
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