Biotin ist ein wasserlösliches Vitamin, es kann von fast allen S. cerevisiae-Stämmen nicht de novo synthetisiert werden und dient als prosthetische Gruppe bei Carboxylierungsreaktionen. Es war bekannt, dass die Bäckerhefe bei einem Mangel an Biotin mit einer Expressionssteigerung des Biotintransportergens VHT1 reagiert [Stolz et al. (1999), J Biol Chem 274, 18741-18746]. Mit Hilfe von ...
Abstract (German)
Biotin ist ein wasserlösliches Vitamin, es kann von fast allen S. cerevisiae-Stämmen nicht de novo synthetisiert werden und dient als prosthetische Gruppe bei Carboxylierungsreaktionen. Es war bekannt, dass die Bäckerhefe bei einem Mangel an Biotin mit einer Expressionssteigerung des Biotintransportergens VHT1 reagiert [Stolz et al. (1999), J Biol Chem 274, 18741-18746]. Mit Hilfe von Sequenzvergleichen konnte in dieser Arbeit in den Promotoren der meisten Gene aus dem Biotinmetabolismus ein konserviertes palindromisches DNA-Element identifiziert werden. Dieses ist als UASBIO notwendig und hinreichend für eine biotinabhängige Regulation. Western Blot- und Reportergenanalysen, untermauert durch Daten aus Microarray- und Nothern Blot-Experimenten, zeigten außerdem, dass neben VHT1 auch die anderen Gene des Biotinmetabolismus bei Biotinmangel aktiviert werden. Der Plasmamembrantransporter Vht1p ist nicht an der Wahrnehmung von Biotin beteiligt. Deletionsmutanten wiesen zwar eine Aktivierung der biotinregulierten Gene auf, dieser Effekt war aber nach der Gabe von Biotinvorstufen, die unabhängig von Vht1p aufgenommen und intrazellulär in Biotin umgewandelt werden, nicht länger zu beobachten. Dabei wurde auch die Wahrnehmung extrazellulären Biotins ausgeschlossen. Im Gegensatz zur Situation beim Ausfall anderer biotintragender Proteine wurde ein Biotinmangelsignal bei einer Deletion beider Pyruvatcarboxylasen, Pyc1p und Pyc2p, komplett verhindert. Somit sind die Pyruvatcarboxylasen essentiell für die Wahrnehmung von Biotin. Der genaue Funktionsmechanismus konnte allerdings noch nicht geklärt werden. Aufgrund dieses Resultats wurde aber neben Vht1p auch der Biotin-Protein-Ligase Bpl1p, einem essentiellen Enzym, welches Biotin auf die Zielproteine überträgt, nur eine indirekte Rolle in der Biotinwahrnehmung zugeschrieben. Wie bei vht1(delta)-Mutanten zeigten bpl1-Mutanten ebenfalls eine deutliche Expressionssteigerung der Biotingene, besaßen aber im Gegensatz zu vht1(delta)-Mutanten normale Konzentrationen an freiem intrazellulären Biotin. Dieses ist deshalb für die Wahrnehmung von Biotinmangel nicht relevant. Um unbekannte Glieder der Biotinsignalkette zu finden, wurde zum einen ein Reporterstamm mit EMS mutagenisiert und zum anderen mit einer multi-copy Genbank transformiert. Es konnten jeweils Klone mit einem konstitutiven Biotinmangelsignal (BHB, �blind for high biotin�) isoliert werden. Nach verschiedenen Tests zur Charakterisierung der Mutanten stehen 15 EMS-Klone für nachfolgende Komplementationstests zur Verfügung. Im anderen Ansatz konnte für keines der sequenzierten Genbankplasmide eine Beteiligung in der Biotinsignalkette nachgewiesen werden. Nichtsdestotrotz zeigt die hier erfolgte Identifizierung von TIS11, dem Gen eines eisenabhängigen Regulatorproteins, eine weitere interessante Verbindung von Biotin- und Eisenmetabolismus auf.
Translation of the abstract (English)
Biotin, a water-soluble vitamin that is an essential nutrient for most yeast species, functions as a prosthetic group in carboxylation reactions. In addition biotin has multiple roles in gene expression. In Saccharomyces cerevisiae increased expression of the biotin transporter gene VHT1 was observed following biotin depletion [Stolz et al. (1999), J Biol Chem 274, 18741-18746].
In this work ...
Translation of the abstract (English)
Biotin, a water-soluble vitamin that is an essential nutrient for most yeast species, functions as a prosthetic group in carboxylation reactions. In addition biotin has multiple roles in gene expression. In Saccharomyces cerevisiae increased expression of the biotin transporter gene VHT1 was observed following biotin depletion [Stolz et al. (1999), J Biol Chem 274, 18741-18746]. In this work sequence alignments identified a conserved palindromic sequence in the promoter regions of most biotin metabolic genes. This sequence functions as an UASBIO and is necessary and sufficient to confer the regulation of genes by biotin. Western blot and reporter gene analyses as well as data from microarray and Northern blot analyses showed that not only VHT1 but also all other biotin metabolic genes are up-regulated after growth in low biotin medium. The plasma membrane biotin transporter protein Vht1p is not involved in sensing biotin depletion. Deletion-mutants lacking this protein display activation of biotin responsive genes, however they react normally to biotin precursors that do not require Vht1p for uptake and are intracellularily converted to biotin. In addition this fact also excludes sensing of extracellular biotin. A low biotin response was not detected after deletion of both isoforms of pyruvat carboxylase, Pyc1p and Pyc2p, in contrast to much lower effects by absence of the other biotin-containing proteins. This indicates that pyruvat carboxylases are essential for sensing biotin. This also means that not only Vht1p but also the biotin-protein ligase Bpl1p, an essential enzyme which catalyses the covalent linkage of biotin to proteins, has merely an indirect function in sensing biotin depletion. Mutants with defects in BPL1, similar to vht1(delta) mutants, showed an increased expression of biotin-responsive genes and reduced levels of protein biotinylation. But unlike vht1(delta) mutants they displayed normal levels of free intracellular biotin. This indicates that free intracellular biotin is irrelevant for regulation of biotin responsive genes. However the exact mechanisms of biotin sensing remains unclear. To detect unknown constituents of the biotin signalling pathway a reporter strain was treated with the mutagen EMS to find mutants with defects in biotin signalling. Alternatively, this strain was transformed with a multi-copy gene bank. Both strategies led to the identification of clones with constitutively high expression of biotin-repressed genes (BHB, �blind for high biotin�). After further characterization of the mutants 15 EMS-clones remained for following complementations. However none of the sequenced gene bank plasmids allowed to draw conclusions about its role in biotin sensing. Nonetheless, the identification of TIS11, a gene encoding an iron regulator protein, displays a further interesting linkage between biotin and iron metabolism.
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