| License: Publishing license for publications excluding print on demand (8MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-opus-14140
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.12379
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) | ||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication | ||||||||||
| Date: | 17 December 2009 | ||||||||||
| Referee: | apl. Prof. Dr Rainer Deutzmann | ||||||||||
| Date of exam: | 26 October 2009 | ||||||||||
| Additional Information (public): | J Cell Biol 178(1): 167-178 | ||||||||||
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Lehrstuhl für Biochemie I > Prof. Dr. Rainer Deutzmann | ||||||||||
| Classification: |
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| Keywords: | Fibronectin , Extrazelluläre Matrix , Assembly , RGD-Sequenz , Genmutation , Embryonalentwicklung , Integrin , pFN , cFN , integrin , fibers , fibrillar matrix , module , disulfide bond | ||||||||||
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences | ||||||||||
| Status: | Published | ||||||||||
| Refereed: | Yes, this version has been refereed | ||||||||||
| Created at the University of Regensburg: | Yes | ||||||||||
| Item ID: | 12379 |
Abstract (English)
Fibronectin (FN), a major adhesive glycoprotein ubiquitously present in the extracellular matrix and in blood plasma of vertebrates, is secreted by cells as a disulfide-bonded dimer. FN requires cell surface expressed integrins to assemble into a functional fibrillar network, which in turn orchestrates the assembly of other ECM components to promote cell adhesion, cell migration and a large ...
Abstract (English)
Fibronectin (FN), a major adhesive glycoprotein ubiquitously present in the extracellular matrix and in blood plasma of vertebrates, is secreted by cells as a disulfide-bonded dimer. FN requires cell surface expressed integrins to assemble into a functional fibrillar network, which in turn orchestrates the assembly of other ECM components to promote cell adhesion, cell migration and a large variety of signaling events.
The most prominent integrin binding site of FN is located in the 10th type-III repeat (FN-III10) and consists of an Arg-Gly-Asp (RGD) motif. This motif is considered to be essential for the initiation and assembly of a fibrillar FN matrix through its capability to bind to a variety of different members of the integrin family. Gene ablation studies confirmed that two RGD-dependent FN assembly mechanisms either induced by integrin alpha-5-beta-1 or alpha-v integrins exist in vivo, and that each of them can compensate for the absence of the other (Yang, Bader et al. 1999). In order to specifically test how FN-RGD binding integrins compensate for each other during development and FN fibrillogenesis, a mouse strain was generated in which the Asp (D) of the RGD motif was substituted with a Glu (E). This mutation resulted in an integrin-binding-deficient RGE motif. FN-RGE homozygous mice die around embryonic day 10 (E10) of development with shortened posterior trunk, absent tail-bud derived somites and severe defects of the cardiovascular system. All these defects are similar to those observed in alpha-5 integrin-null mice. Surprisingly, the absence of a functional RGD binding site did not abolish assembly of a FN matrix in mutant embryos or on cells derived from mutants. Matrix assembly assays and solid-phase binding assays performed in this study reveal that alpha-v-beta-3 integrin assembles FN-RGE by binding to an isoDGR-motif in FN-I5, which is generated by the non-enzymatic rearrangement of Asn (N) into iso-Asp (isoD). This study unravelled a novel motif for integrin binding and fibril formation in FN whose activity is controlled by amino acid modification.
The dimerization of FN is facilitated by two cysteines at the C-terminus which are forming a pair of disulfide-interchain bonds. Fibronectin dimerization has been shown to be essential for the assembly of a fibrillar FN matrix network in vitro. To directly test the function of the dimerization in vivo, a mouse strain was generated that is exclusively expressing a monomeric form of FN by exchanging the two cysteines (C) against two serines (S). This study shows that FN-monomer homozygous mice die around E11.0, displaying severe cardiovascular defects and a growth arrest commencing around E9.0 � E9.5. Interestingly, these defects are similar to those observed in mouse models with compromised TGF-beta signaling. Moreover, monomeric FN was assembled into a FN matrix in mutant embryos. Matrix assembly assays and biochemical analyses revealed that FN-monomer is also assembled in vitro, but fails to orchestrate assembly of other ECM proteins such as LTBP-1 leading to an impaired targeting of latent TGF-beta to the ECM. This in turn leads to altered TGF-beta signaling underlying the cardiovascular defects. This study demonstrates that dimeric FN is not required for FN fibril assembly in vivo, but is essential for sequestration and activation of TGF-beta and normal FN fibrillogenesis in vitro.
Translation of the abstract (German)
Fibronektin (FN) ist ein in Wirbeltieren fast ubiquitär vorkommendes, adhäsives Glykoprotein der Extrazellulären Matrix und des Blutplasmas. FN wird von Zellen als Disulfid-verbrücktes Dimer sezerniert, welches erst durch die Interaktion mit Integrin-Zelloberflächenrezeptoren zu einem funktionalen faserigen FN-Netzwerk zusammengesetzt wird. Dieses Netzwerk beeinflusst nicht nur Prozesse wie ...
Translation of the abstract (German)
Fibronektin (FN) ist ein in Wirbeltieren fast ubiquitär vorkommendes, adhäsives Glykoprotein der Extrazellulären Matrix und des Blutplasmas. FN wird von Zellen als Disulfid-verbrücktes Dimer sezerniert, welches erst durch die Interaktion mit Integrin-Zelloberflächenrezeptoren zu einem funktionalen faserigen FN-Netzwerk zusammengesetzt wird. Dieses Netzwerk beeinflusst nicht nur Prozesse wie Zelladhäsion und Zellmigration, sondern auch eine Vielzahl von molekularen Signalübertragungs-Prozessen, und trägt außerdem zur Assemblierung zahlreicher extrazellulärer Matrixkomponenten bei.
Fibronektins wohl bekannteste Bindungsstelle für Integrine besteht aus einem Arg-Gly-Asp Motiv (RGD), welches im zehnten Typ-III Modul (FN-III10) des Moleküls lokalisiert ist. Das Motiv gilt als essentiell für die Initiale Ausbildung einer feinfaserigen FN Matrix, was auf seine Fähigkeit zur Interaktion mit einer großen Zahl verschiedener Mitglieder der Integrin-Familie zurückzuführen ist. Knock-out Studien haben gezeigt, daß in vivo zwei RGD abhängige FN Assemblierungsmechanismen existieren, die entweder durch alph-5-beta-1 oder alpha-v Integrine getrieben werden. Beide Assemblierungsmechanismen können das Fehlen des jeweils anderen funktionell kompensieren.
Um die Redundanz RGD bindender Integrine für die FN Assemblierung und während der Embryonalentwicklung zu untersuchen, wurde eine Mauslinie erzeugt, in deren RGD Motiv das Aspartat (D) durch ein Glutamat (E) ersetzt wurde (RGE). Durch die Mutation RGD > RGE verliert das Motiv seine Funktion und kann nicht mehr mit RGD bindenden Integrinen interagieren.
Homozygote FN-RGE Mäuse sterben um Tag 10 der Embryonalentwicklung mit verkürztem Rumpfende, fehlenden, aus der Schwanzknospe gebildeten Somiten, und mit schwerwiegenden Entwicklungsdefekten des kardiovaskulären Systems. Der Phänotyp homozygoter FN-RGE Mutanten erinnert stark an den alpha-5 Integrin knock-out Phänotyp. Überraschenderweise führt das Fehlen eines funktionellen RGD-Motivs weder zu einer Störung des FN Netzwerkaufbaus in den homozygoten FN-RGE Embryonen, noch auf isolierten Zellen dieses Genotyps in Kultur.
Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten FN Matrix-Assemblierungs-Versuche und Festphasen-Bindungsstudien zeigen, daß alpha-v-beta-3 Integrin den Aufbau eines FN-RGE Netzwerks durch Bindung an ein alternatives Motiv ermöglicht, welches in Modul I5 lokalisiert ist. Dieses erst kürzlich entdeckte isoDGR-Motiv entsteht extrazellulär durch spontane Desamidierung von Asn (N) zu isoAsp (isoD), wodurch die Integrin-Bindungsaktivität an FN, und in der Folge auch der FN Matrixaufbau durch posttranslationale Modifikation reguliert werden kann. Der erste Teil dieser Arbeit zeigt erstmals die Relevanz dieses neuen Motivs für die Embryonalentwicklung, sowie für die Assemblierung einer FN Matrix in vivo und in vitro.
Fibronektins Dimerisierung erfolgt durch Ausbildung zweier Disulfidbrücken zwischen Cystein-Paaren am C-Terminus des Moleküls. In Zellkulturexperimenten wurde gezeigt, daß Fibronektin nur als Dimer in der Lage ist ein Matrix Netzwerk aufzubauen. Um die Gültigkeit dieses Befundes in vivo zu untersuchen, wurde ein Mausstamm hergestellt, der ausschließlich monomeres FN exprimiert, was durch den Austausch der beiden C-terminalen Cysteine gegen Serine erreicht wurde.
Homozygote FN-monomer Mäuse sterben an Tag 11 (E11) der Embryonalentwicklung. Ihr Phänotyp ist von schweren kardiovaskulären Defekten und einen ab E9-E9.5 einsetzenden Wachstumsarrest gekennzeichnet. Interessanterweise ähnelt das Erscheinungsbild der homozygoten Mutanten stark jenen Phänotypen, die aus veränderten TGF-beta Signalübertragungs-Prozessen resultieren. Es stellte sich zudem überraschenderweise heraus, daß monomeres FN in vivo ein Netzwerk bilden kann. Die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Matrix Assemblierungs-Versuche und biochemischen Analysen zeigen, daß monomeres FN auch in vitro assembliert wird. Die Matrix aus monomerem FN ist jedoch nicht in der Lage, andere ECM Komponenten - wie beispielsweise LTBP-1 - in die Matrix zu integrieren. Dies führt zu einer veränderten Einlagerung von latentem TGF-beta in die ECM. Diese Fehlfunktion führt zu veränderter TGF-beta Signalübertragung, was letztlich die beobachteten kardiovaskulären Defekte verursachen könnte.
Die vorliegenden Arbeit zeigt, daß Fibronektins Zustand als Dimer in vivo nicht essentielle für die Assemblierung eines FN Netzwerks ist, daß es jedoch eine essentielle Bedeutung für die Verankerung und Aktivierung von latentem TGF-beta, sowie für die normale Ausbildung von FN Fasern in vitro besitzt.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 10:49
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