| Lizenz: Veröffentlichungsvertrag für Publikationen mit Print on Demand (7MB) |
- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-134059
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.13405
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 10 Mai 2010 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof. Dr. Michael Thomm |
| Tag der Prüfung: | 27 April 2009 |
| Institutionen: | Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Lehrstuhl für Mikrobiologie (Archaeenzentrum) > Prof. Dr. Michael Thomm |
| Stichwörter / Keywords: | RNA Polymerase, hybrid, Transkription, Rpb5, RpoH, Rpb12, RpoP, Archaea, RNA polymerase, hybrid, transcription, Rpb5, RpoH, Rpb12, RpoP, Archaea |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 13405 |
Zusammenfassung (Deutsch)
Das Ziel dieser Arbeit war, zu untersuchen, ob ein direkter Austausch von RNAP Untereinheiten zwischen den Domänen der Eukarya und der Archaea möglich ist. Insbesondere sollte die Funktion der kleinen Untereinheiten RpoP/Rpb12 und RpoH/Rpb5 im Enzymkomplex aufgeklärt werden. Es wurden dazu die Vorzüge von zwei bisher getrennt betrachteten Modellorganismen und Systemen gebündelt. In der Hefe ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Das Ziel dieser Arbeit war, zu untersuchen, ob ein direkter Austausch von RNAP Untereinheiten zwischen den Domänen der Eukarya und der Archaea möglich ist. Insbesondere sollte die Funktion der kleinen Untereinheiten RpoP/Rpb12 und RpoH/Rpb5 im Enzymkomplex aufgeklärt werden. Es wurden dazu die Vorzüge von zwei bisher getrennt betrachteten Modellorganismen und Systemen gebündelt. In der Hefe Saccharomyces cerevisiae konnte das etablierte Methodenspektrum und ein ausgereiftes genetisches System genutzt werden. Das archaeelle System bietet die Möglichkeit die RNAP aus elf Untereinheiten zu rekonstituieren. Auf diese Weise sollten zwei sich ergänzende Ansätze zur Klärung von Struktur-Funktionsbeziehungen eingesetzt werden.
Im Hefesystem wurde untersucht, ob archaeelle Untereinheiten die eukaryotischen RNAP in vivo komplementieren können oder welche Funktion sie dort noch unterstützen können. Mit Hilfe der rekonstituierbaren archaeellen RNAP konnten eukaryotische Untereinheiten auf ihre Aktivität im archaeellen System getestet werden. Mit dem Ziel einer Funktionszuordnung wurden archaeelle RNAP, die ohne die Untereinheiten RpoH oder RpoP rekonstituiert worden waren untersucht, und zusätzlich mutierte Varianten der Untereinheit RpoP getestet.
Die Versuche lieferten Einblicke in die bisher kaum verstandene Funktion von RpoP/Rpb12 und RpoH/Rpb5. Die Abwesenheit von RpoH in einer rekonstituierten archaeellen RNAP führte zu starken Defekten bei allen Schritten des Transkriptionszyklus. RpoH ist zur C terminalen Domäne von Rpb5 homolog und die N terminale Domäne von Rpb5 fehlt bei den Archaea. RpoH scheint, ähnlich wie die C terminale Domäne von Rpb5, Einfluss auf die Stabilität des aktiven Zentrums zu nehmen.
Die zweite detailliert untersuchte Untereinheit ist RpoP. Die bisher angenommene Rekrutierungsfunktion beim Aufbau der RNAP aus den Untereinheiten erscheint im Lichte dieser Daten als unwahrscheinlich. Hingegen ist RpoP für die Ausbildung des offenen Komplexes notwendig. Das N-terminale Zink-Ribbon hat Einfluss auf die Gesamtstruktur der Untereinheit, die in direktem Zusammenhang mit einer korrekten Interaktion im Enzymkomplex steht. Die konservierte C-terminale Domäne allein ist ausreichend alle wesentlichen Funktionen der RNAP zu unterstützen.
Die eukaryotischen Untereinheiten Rpb12 und Rpb5 konnten anstelle ihrer archaeellen Homologe RpoP und RpoH in eine archaeelle RNAP rekonstituiert werden. Aktivitätstests haben gezeigt, dass die eukaryotischen Untereinheiten aus der mesophilen Hefe im hyperthermophilen in vitro Transkriptionssystem alle wesentlichen Funktionen wahrnehmen können. Die archaeelle Untereinheit RpoH, in Fusion mit der N-terminalen Domäne von Rpb5, wird bei Überexpression in der Hefezelle in die RNAP II eingebaut und führt zu einem in vitro aktiven Enzym. Die archaeelle Untereinheit RpoP, unter der Kontrolle eines starken Hefepromotors, kann sogar alle essentiellen Funktion von Rpb12 in vivo ersetzen. Es ist demnach ein direkter Austausch von Untereinheiten zwischen den eukaryotischen und der archaeellen RNAP möglich.
Der Nachweis macht deutlich, dass die RNAP der archaeellen und eukaryotischen Domäne nicht nur große Ähnlichkeiten aufweisen, sondern dass Untereinheiten funktionell austauschbar sind. Die Grundstrukturen, die unter anderem wichtig für die Protein-Protein Wechselwirkungen der Untereinheiten sind, blieben trotz einer Zunahme an Komplexität im eukaryotischen System erhalten und deuten auf eine evolutionäre Konservierung hin.
Das hybride Hefe/Pyrococcus System erbrachte damit biochemische Belege für die evolutionär nahe Verwandtschaft der archaeellen und eukaryotischen Transkriptionssysteme.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
The aim of this work was to investigate if a direct substitution of RNAP subunits between the eukaryal and archaeal domain was possible. Furthermore the essential functions of the small subunits RpoH/Rpb5 and RpoP/Rpb12 in the enzyme were analysed. In order to do this the benefits of two different model organisms and systems were pooled. In the yeast Saccharomyces cerevisiae a well established ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
The aim of this work was to investigate if a direct substitution of RNAP subunits between the eukaryal and archaeal domain was possible. Furthermore the essential functions of the small subunits RpoH/Rpb5 and RpoP/Rpb12 in the enzyme were analysed. In order to do this the benefits of two different model organisms and systems were pooled. In the yeast Saccharomyces cerevisiae a well established range of methods and a sophisticated genetic system could be used. The combination with the basic archaeal system, which allows the reconstitution of the RNAP from 11 subunits, made it possible to benefit from two complementing approaches in order to investigate structure-function relationships.
In the yeast system it was analysed if archaeal subunits could complement the eukaryotic RNAP in vivo or which functions they could still support. Using the reconstituted archaeal RNAP eukaryotic RNAP subunits were tested for their activity in the archaeal system. In order to achieve a functional characterization of the subunits, RNAP lacking RpoH or RpoP and mutated variants of RpoP were analysed.
The joined attempts elucidated the enigmatic functions of RpoP/Rpb12 and RpoH/Rpb5. The absence of RpoH in a reconstituted RNAP led to severe defects in all steps of the transcription cycle. RpoH is homologous to the C terminal domain of Rpb5 and the N terminal domain of Rpb5 is absent in Archaea. RpoH, like the C terminal domain of Rpb5, seems to influence the stability of the active centre.
The second subunit investigated in detail was RpoP. The data presented here strongly contradicts the assumed function in the recruitment of the catalytic subunits. However RpoP is crucial for the open complex formation. The N terminal zinc-ribbon is important for the overall structure of the subunit, which is directly related to a correct interaction in the enzyme complex. The conserved C terminal domain alone can support all basic functions in the RNAP.
The eukaryotic subunits Rpb12 and Rpb5 were incorporated into an archaeal RNAP, instead of their archaeal homologues RpoP and RpoH. Activity tests showed that the eukaryotic subunits from the mesophilic yeast can support all major functions in the hyperthermophilic archaeal in vitro transcription system. During overexpression in yeast cells archaeal RpoH, in fusion with the N-terminal domain of Rpb5, is incorporated into a transcriptionally active RNAP II. The archaeal subunit RpoP, under the control of a strong yeast promotor, can even complement all essential functions of Rpb12 in vivo. According to this a direct substitution of subunits between the eukaryotic and archaeal RNAP is possible.
The evidence presented here supports the idea that RNAP of Archaea and Eukarya are not only very similar but that subunits can be functionally exchanged. The basic structures, which are important for protein-protein interactions of the subunits, are in spite of the increase in complexity in the eukaryotic system, preserved and are indicative of an evolutionary conservation.
The described chimeric yeast/Pyrococcus system provides biochemical evidence for the evolutionary relationship of the archaeal and eukaryotic transcription system.
Metadaten zuletzt geändert: 26 Nov 2020 09:59
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