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- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-143831
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.14383
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Number of Pages: | 67 |
| Date: | 10 May 2010 |
| Referee: | Prof. Dr. Marina Kreutz and Prof. Dr. Anja Bosserhoff |
| Date of exam: | 30 March 2010 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Innere Medizin III (Hämatologie und Internistische Onkologie) |
| Keywords: | T-Zellen, Milchsäure, Tumormetabolismus |
| Dewey Decimal Classification: | 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 14383 |
Abstract (German)
Obgleich eine der Hauptaufgaben des erworbenen Immunsystems, insbesondere der zytotoxischen T-Lymphozyten die Erkennung und Eliminierung von Tumorzellen ist, gehören maligne Erkrankungen zu den drei häufigsten Todesursachen unserer westlichen Gesellschaft. Es ist nachgewiesen, dass im Tumorgewebe durch einen hohen glykolytischen Metabolismus ein Milieu mit niedrigem pH-Wert und hoher ...
Abstract (German)
Obgleich eine der Hauptaufgaben des erworbenen Immunsystems, insbesondere der zytotoxischen T-Lymphozyten die Erkennung und Eliminierung von Tumorzellen ist, gehören maligne Erkrankungen zu den drei häufigsten Todesursachen unserer westlichen Gesellschaft. Es ist nachgewiesen, dass im Tumorgewebe durch einen hohen glykolytischen Metabolismus ein Milieu mit niedrigem pH-Wert und hoher Milchsäurekonzentration herrscht. Bei humanen dendritischen Zellen konnte bereits gezeigt werden, dass diese in ihrer Fähigkeit der Antigenpräsentation unter dem Einfluss von Milchsäure in vitro gehemmt werden. In der vorliegenden Arbeit beschäftigte uns der Effekt des Tumormilieus auf T-Lymphozyten als zentrale Effektorzellen einer Immunantwort im Tumor. Zielsetzung war es, die Effekte der Milchsäure auf antigenspezifische CD8-positive zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) und CD4-positive Jurkat-T-Zellen näher zu untersuchen.
Humane Melan A-spezifische CTL und Jurkat-T-Zellen wurden mit unterschiedlichen Konzentrationen Milchsäure (MS) inkubiert. Sowohl für CTL aus auch für Jurkat-T-Zellen ergab sich mit zunehmender MS-Konzentration eine signifikante Proliferationshemmung der Zellen. In ergänzenden Proliferationsversuchen mit einer CFSE-Färbung über 3 Tage konnte gezeigt werden, dass Natrium-Laktat, das Natrium-Salz der Milchsäure einen abgeschwächten Effekt auf das Zellwachstum zeigt im Vergleich zu Milchsäure in gleicher Konzentration. Analysen zur Reversibilität des MS-Effektes erbrachten keinen Hinweis auf eine erneute Proliferation der T-Zellen.
Bei Untersuchungen zum Apoptoseverhalten von T-Lymphozyten war ein zunehmender Zellverlust mit steigender MS-Konzentration zu beobachten. Erwartungsgemäß tolerierten Jurkat-T-Zellen höhere Konzentrationen an MS als CTL. Dies lässt vermuten, dass unter dem Einfluss höherer Konzentrationen an Milchsäure die beobachtete Proliferationshemmung auf einem zunehmenden Zellverlust an T-Lymphozyten beruht.
In Anlehnung an die physiologische Situation wurde mit humanen dendritischen Zellen (DC) und allogenen T-Lymphozyten eine gemischte Lymphozytenreaktion über 7 Tage unter dem Einfluss von Milchsäure durchgeführt. Auch die CD4-positiven T-Lymphozyten zeigten eine signifikante Wachstumshemmung unter dem Einfluss von Milchsäure.
T-Lymphozyten bedienen sich während ihrer Aktivierung aufgrund eines massiv gesteigerten Energiebedarf der Glykolyse. Der anfallende Metabolit Laktat bzw. Milchsäure muss aus der Zelle transportiert werden, um eine Ansäuerung zu verhindern. Für den Abtransport der Anionen besitzt die T-Zelle Monocarboxylattransporter (MCT), die einen gradientenabhängigen Transport über die Plasmamembran gewährleisten. MCT waren durchflusszytometrisch auf Jurkat-T-Zellen nur gering und auf CTL gar nicht nachweisbar. Im Western Blot allerdings gelang auch der Nachweis von MCT-1 und MCT-2 auf CTL. Ergänzend erfolgten Versuche zum Einfluss des Glykolyseinhibitors 2-Deoxyglucose (2-DG). Obgleich unter dem Effekt von 2-DG der MS-Gehalt in den Zellüberständen der T-Lymphozyten abnahm, zeigte sich für die eingesetzten Jurkat-T-Zellen keine statistisch signifikante Wachstumshemmung.
Zudem wurden Analysen zur Zellproliferation unter dem Einfluss von Zimtsäure (CINN) durchgeführt. Bei CINN handelt es sich um einen MCT-Inhibitor. Der gradientenbedingte Abtransport von Laktat über die Plasmamembran wird hierdurch empfindlich gestört und es resultiert eine intrazelluläre Akkumulation an MS. Es konnte gezeigt werden, dass aus einer steigenden MS-Konzentration im Zellüberstand aufgrund einer Gradientenumkehr eine MS-Aufnahme in die Zelle resultiert. Unter dem Einfluss von CINN war eine signifikante Reduktion an MS im Zellüberstand sowie eine signifikante Wachstumshemmung der T-Zellen zu beobachten.
Untersuchungen zum Einfluss von Interleukin-2 (IL-2), einem wichtigen Zytokin für die Interaktion und Aktivierung der T-Zelle ergaben auf mRNA- und Proteinebene eine signifikant supprimierte Expression. Analysen zum Umkehrschluss, dass unter Zugabe von IL-2 eine Proliferationssteigerung unter dem Effekt von MS resultieren würde, bestätigten sich nicht.
Es ist bekannt, dass durch gesteigerte Glykolyse im Tumorgewebe große Mengen an extrazellulärem Stoffwechselendprodukt Milchsäure bzw. Laktat anfällt. Die MCT der T-Lymphozyten sind wahrscheinlich bei steigender extrazellulären Milchsäurekonzentration nicht mehr im Stande anfallendes Laktat ausreichend aus der Zelle zu schleusen, wodurch eine Blockade in den für die T-Zellaktivierung wichtigen metabolischen Prozessen der Glykolyse stattfindet und die Immunzellen entscheidend in ihrem Verhalten gehemmt werden.
Zusammenfassend wurde festgestellt, dass ein hoher Laktatgehalt im Tumormilieu den Abtransport von MS aus der T-Zelle blockiert. Hieraus resultiert eine Hemmung der Proliferation sowie der Zytokinproduktion und begünstigt die Apoptose von T-Lymphozyten. Strategien, diese metabolischen Mechanismen zu umgehen könnten helfen in Zukunft Tumoren mit einer wirksamen immunologischen Therapie zu bekämpfen.
Translation of the abstract (English)
Although one of the main functions of acquired immune system, especially of cytotoxic T lymphocytes is the recognition and elimination of tumor cells, malignant disease belong to the most frequent causes of death in western society. There is evidence that in tumor tissue a decreased pH value and a high concentration of lactic acid predominate because of increased glycolitic metabolism of the ...
Translation of the abstract (English)
Although one of the main functions of acquired immune system, especially of cytotoxic T lymphocytes is the recognition and elimination of tumor cells, malignant disease belong to the most frequent causes of death in western society. There is evidence that in tumor tissue a decreased pH value and a high concentration of lactic acid predominate because of increased glycolitic metabolism of the tumor. It is known that human dendritic cells are inhibited in there function of antigen presentation by lactic acid in vitro. In this work we were interested in the effect of components of the tumor milieu on T lmyphocytes as central effector cells of the immune response. Aim was to analyse the effect of lactic acid on antigen specific CD8 positive cytotoxic T lymphocytes (CTL) and CD4 positive Jukat T cells.
Human melan A-specific CTL and Jurkat T cells were incubated with different concentrations of lactic acid. A significant inhibition of proliferation for CTL as well as for Jurkat T cells could be shown with increasing concentration of lactic acid. In supplementary trials concerning proliferation with CFSE over 3 days it was shown that sodium lactate, the sodium salt of lactic acid, had a weakened effect on cell proliferation in comparison to the same concentration of lacic acid. Analyses to reversibility of the lactic acid effect gave no hint on refreshing T cell proliferation.
Examination on apoptosis of T lymphocytes showed an augmented cell loss with increasing concentration of lactic acid. As expected, Jurkat T cells tolerated higher concentrations of lactic acid than CTL. These findings suppose an increasing influence on T cell loss during inhibition of proliferation with higher lactic acid concentrations.
Appropriate to the physiological situation human dendritic cells and allogeneic T lymphocytes were incubated in a mixed lymphocyte reaction (MLR) for 7 days together with lactic acid. There was also a significant influence of lactic acid on the proliferation of CD4 positive T lymphocytes.
During there activation T lymphoctes use glycolysis for there energy supply because of great demand on sudden energy. To avoid an intracellular acidification the glycolytic metabolite lactate respectively lactic acid has to be transported out of the cell. For transport of anions out of the cell, T lymphocytes express monocarboxylate transporters (MCT) which assure the transport via the plasma membrane. Our results showed that MCT could just a little be detected on Jurkat T cells and were not detectable on CTL via flowcytometry. But MCT-1 and MCT-2 could be proven on CTL in western blot. Additionally there were trials on the influence of the inhibitor of glycolysis, 2-deoxyglucose (2-DG). Although under the effect of 2-DG the concentration of lactic acid in T cell supernantants decreased, no significant inhibition of cell proliferation of Jurkat T cells was detected.
Further analyses to the influence of cinnamon acid (CINN) were done. CINN is an inhibitor of MCT. In consequence the transport of lactate out of the cell via the plasma membrane is sensitively disturbed and there results an accumulation of intracellular lactic acid. It was shown that an increasing concentration of lactic acid in the cell supernantant causes an uptake of lactic acid into the cell by reversal of the concentration gradient. By the effect of CINN there resulted a significant reduction of lactic acid in the cell supernantant and a significant inhibition of T cell proliferation.
Analyses to the influence of interleukin-2 (IL-2) an important cytokine for interaction and activation of T lymphocytes showed significant suppressed expression on mRNA and protein level under the influence of lactic acid. Trials about the converse argument that proliferation could increase due to addition of IL-2 to incubated cells with lactic acid, did not valid.
It is known that because of increased glycolysis in tumor tissue there results a great amount of the extracellular metabolite lactic acid. MCT can probably not transport lactate out of the cell with increasing extracellular concentration of lactic acid. Therefore results a blockade in important metabolic processes during the activation of the T lymphocyte and the immune cells are inhibited.
In conclusion it was shown that a high concentration of lactic acid in the tumor microenvironment inhibits the efflux of lactic acid out of the T lymphocyte. It results an inhibition of proliferation as well as cytokine production and favours apoptosis of T lymphocytes. Strategies to avoid these metabolic mechanisms could help to find an effective immunological therapy against tumors in near future.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 09:30
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