| License: Publishing license for publications including print on demand (8MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-145298
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.14529
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 18 January 2011 |
| Referee: | Prof. Dr. Michael Thomm |
| Date of exam: | 17 March 2010 |
| Institutions: | Biology, Preclinical Medicine > Institut für Biochemie, Genetik und Mikrobiologie > Lehrstuhl für Mikrobiologie (Archaeenzentrum) > Prof. Dr. Michael Thomm |
| Interdisciplinary Subject Network: | Not selected |
| Keywords: | Transkriptionsregulation, Zuckerstoffwechsel, TrmB, TrmBL1, Pyroccocus furiosus, Repressoren, Aktivatoren |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 14529 |
Abstract (German)
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit Untersuchungen zur Funktionsweise der beiden zuckerspezifischen Transkriptionsregulatoren TrmB und TrmBL1 innerhalb des Zuckerstoffwechsels des hyperthermophilen Archaeons Pyrococcus furiosus. Die Aufnahme von Kohlenhydraten in die Zelle wird bei P. furiosus von zwei substratspezifischen ABC–Transportern vermittelt. Der Maltose/Trehalose-Transporter ...
Abstract (German)
Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit Untersuchungen zur Funktionsweise der beiden zuckerspezifischen Transkriptionsregulatoren TrmB und TrmBL1 innerhalb des Zuckerstoffwechsels des hyperthermophilen Archaeons Pyrococcus furiosus.
Die Aufnahme von Kohlenhydraten in die Zelle wird bei P. furiosus von zwei substratspezifischen ABC–Transportern vermittelt. Der Maltose/Trehalose-Transporter ist dabei ausschließlich für den Transport von Maltose und Trehalose zuständig, während der Maltodextrin (MD)–Transporter spezifisch für die Aufnahme von Maltodextrinen ist. Beide Transportsysteme sind auf genetischer Ebene in Genclustern zusammengefasst, deren Expression sowohl von TrmB als auch von TrmBL1 kontrolliert wird. Mit Hilfe von in-vitro-Experimenten konnte nachgewiesen werden, dass die beiden Regulatoren an die jeweilige Promotorregion binden und so die Rekrutierung von Transkriptionsfaktoren bzw. RNA–Polymerase verhindern, was zu einer Hemmung der Transkription führt. Die TrmB–vermittelte Transkriptionsrepression wird am TM–Promotor durch Maltose und Trehalose wieder aufgehoben, während Maltodextrine und Sucrose für den MD–Promotor Induktoren sind.
Für TrmBL1 wirkt Maltose an beiden Promotoren als Induktor.
Neben den genannten Induktoren konnten für TrmB auch promotorspezifische Co–Repressoren identifiziert werden. Glucose wirkt am TM– und MD–Promotor als Anti–Induktor und verstärkt die Bindung des Repressors an die DNA und damit die TrmB–vermittelte Transkriptionshemmung. Des Weiteren konnte festgestellt werden, dass die Induktoren des MD–Systems, Maltotriose und Sucrose, als Anti–Induktoren am TM–System wirken und umgekehrt.
TrmBL1 ist homolog zu TrmB und reguliert die Expression von Genen, die für Enzyme der Glycolyse und der Gluconeogenese kodieren. Bei Bindung an die entsprechenden Promotorregionen erkennt TrmBL1 das palindromische TGM–Motiv als Zielsequenz und kann darüber hinaus sowohl als Repressor als auch als Aktivator wirken.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde nachgewiesen, dass bei Bindung von TrmBL1 an die Promotorregion die Expression des glycolytischen Enzyms Phosphofructokinase (PFK) gehemmt wird. Als Induktoren wirken hier Maltose, Maltotriose und Fructose.
Im Gegensatz dazu aktiviert TrmBL1 die Transkription des PF0613–Gens, welches für das gluconeogenetische Enzym Fructose–1,6–Bisphosphatase (FBPase) kodiert. Damit fungiert TrmBL1 als Repressor der Glycolyse und als Aktivator der Gluconeogenese. Es wird vermutet, dass die Position des TGM–Motivs stromabwärts oder stromaufwärts der BRE/TATA–Box bestimmt, ob TrmBL1 die Transkription reprimiert oder aktiviert.
DNaseI Footprinting– und in-vitro-Transkriptionsversuche bestätigten außerdem, dass auch TrmB an den PFK–Promotor binden und die Transkription dort reprimieren kann.
Ferner konnte in dieser Arbeit festgestellt werden, dass TrmBL1 auch seine eigene Synthese autoreguliert, indem es an den TrmBL1–Promotor bindet und so die Transkription reprimiert, wobei Glucose als Induktor wirkt. Da der TrmBL–Promotor kein TGM–Motiv besitzt, lieferte dies auch den Beweis, dass diese Konsensussequenz nicht essentiell für die Promotorerkennung durch TrmBL1 ist.
Die Tatsache, dass TrmB auch an der Regulation der Zielpromotoren von TrmBL1 beteiligt ist und umgekehrt, lässt auf ein weitverzweigtes Regulationsnetzwerk innerhalb des Zuckermetabolismus von P. furiosus schließen, in dessen Zentrum die Regulatoren TrmB und TrmBL1 stehen.
Im Rahmen dieser Arbeit konnte belegt werden, dass sowohl TrmB als auch TrmBL1 einzigartige Eigenschaften besitzen, die bisher noch für keinen prokaryotischen Regulator beschrieben wurden: Beide Regulatoren erkennen unterschiedliche Nukleotidsequenzen an verschiedenen Promotoren und besitzen eine ausgeprägte, promotorabhängige Substratspezifität. Man geht davon aus, dass diese Regulatoren bei der Bindung an verschiedene Nukleotidsequenzen unterschiedliche Konformationen einnehmen und folglich auch verschiedene Zucker als Induktoren erkennen.
Eine Mutationsanalyse der DNA–Bindedomäne von TrmB und TrmBL1 enthüllte eine weitere einzigartige Eigenschaft dieser außergewöhnlichen Regulatorproteine. Beide besitzen mindestens zwei verschiedene HTH–Motive und erkennen ihre jeweiligen Zielpromotoren mit unterschiedlichen Helices innerhalb ihrer N–terminalen DNA–Bindedomänen. In-vitro-Experimente belegten, dass TrmB mit seiner HTH 1–Struktur (AS 33–54) an den TM–Promotor bindet, wobei das Tyrosin an Position 50 essentiell zur Promotorerkennung ist. Der MD–Promotor wird dagegen mit der HTH 2–Struktur (AS 83–104) erkannt und gebunden, wobei das Glutamat an Position 87 eine entscheidende Rolle spielt.
Auch TrmBL1 besitzt zwei verschiedene Bindehelices. Die HTH 1–Struktur (AS 32–53) scheint bei der Erkennung von Promotoren mit TGM–Motiv ausschlaggebend zu sein, während über die HTH 2–Struktur (AS 80–99) Promotoren ohne TGM–Motiv gebunden werden.
Translation of the abstract (English)
In the present work the regulatory mechanism of the two sugar–specific transcriptional regulators TrmB and TrmBL1 of the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus was examined. In P. furiosus the uptake of carbohydrates into the cell is mediated by two substrate–specific ABC transporters. The maltose/trehalose (TM) transporter is responsible for the uptake of maltose and trehalose only, ...
Translation of the abstract (English)
In the present work the regulatory mechanism of the two sugar–specific transcriptional regulators TrmB and TrmBL1 of the hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus was examined.
In P. furiosus the uptake of carbohydrates into the cell is mediated by two substrate–specific ABC transporters. The maltose/trehalose (TM) transporter is responsible for the uptake of maltose and trehalose only, whereas the maltodextrin (MD) transporter is specific for maltodextrins. On the genetic level both transporters are organized in gene clusters with TrmB and TrmBL1 controlling their expression. The results of in vitro experiments provided evidence that both regulators bind to the respective operator sites and thus inhibit transcription by preventing further binding of transcription factors and RNA polymerase recruitment. The TrmB–meditated repression of transcription on the TM promoter is released by maltose and trehalose, whereas maltodextrins and sucrose are inducers for the MD promoter. For TrmBL1 maltose acts as inducer for both promoters.
Apart from the already mentioned inducers promoter–specific co–repressors also were identified for TrmB. Glucose acts as an anti–inducer for both TM and MD promoter by enhancing the binding of the repressor to the DNA and thus increasing TrmB–mediated inhibition of transcription. Furthermore it could be shown that the inducers of the TM system act as anti–inducers for the MD system and vice versa.
TrmBL1 is homologue to TrmB and is involved in the regulation of genes encoding glycolytic and gluconeogenetic enzymes, respectively, where it recognizes a conserved sequence motif called TGM. In contrast to TrmB, which proved to only inhibit transcription, TrmBL1 can act both as repressor and activator.
The results of this work show that the expression of the glycotytic enzyme phosphofructokinase (PFK) is repressed, when TrmBL1 binds to the respective promoter region with maltose, maltotriose, and fructose being inducers and releasing TrmBL1–mediated inhibition of transcription. On the other hand TrmBL1 activates transcription of the gene encoding the gluconeogenetic enzyme fructose–1,6–bisphosphatase (FBPase). Thus TrmBL1 is a repressor for glycolysis and an activator for gluconeogenesis. It is postulated that the position of the TGM motif downstream or upstream of the BRE/TATA box defines whether TrmBL1 represses or activates transcription.
DNaseI footprinting as well as in vitro transcription assays proved that TrmB also binds to the PFK promoter and inhibits transcription on this promoter.
In addition, it could be shown that TrmBL1 autoregulates its own expression by binding to its promoter and repressing transcription with glucose acting as inducer. Since the TGM is not present in the promoter region of the TrmBL1 gene, this motif is not essential for TrmBL1 promoter recognition.
The results of this work provide evidence that TrmBL1 recognizes the target promoters of TrmB and vice versa. This implies that both regulators play a crucial role in the cross regulatory network of sugar metabolism in P. furiosus. Furthermore this work revealed that TrmB and TrmBL1 share unique properties that have been described for the first time for prokaryotic regulators. Both regulators recognize different nucleotide sequences on different promoters and show distinctive, promoter–dependent sugar specificity. It is postulated here that these regulators take up different conformations when binding to different nucleotide sequences and consequently also recognize different inducers in a promoter–depended manner.
A mutational analysis of the DNA binding domain of both TrmB and TrmBL1 revealed another unique feature of these exceptional regulator proteins. Each of them has at least two different HTH motifs and recognizes its respective target promoters with different helices within its N–terminal DNA binding domain.
In vitro experiments proved that TrmB binds with its HTH 1 region (AS 33–54) to the TM promoter with the tyrosine on position 50 being essential for promoter recognition. The MD promoter, however, is bound with another region, the HTH 2 (AS 83–104), with the glutamate on position 87 being crucial for promoter binding.
Also TrmBL1 has two different binding helices, with the HTH 1 region (AS 32–53) being involved in the binding to promoters with a TGM, and the HTH 2 region (AS 80–99) recognizing promoters without a TGM.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 09:29
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