| License: Publishing license for publications excluding print on demand (3MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-160391
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.16039
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Open Access Type: | Primary Publication |
| Date: | 12 October 2010 |
| Referee: | Prof. Dr. Jörg Heilmann and Prof. Dr. Matthias Hamburger |
| Date of exam: | 27 September 2010 |
| Institutions: | Chemistry and Pharmacy > Institute of Pharmacy > Pharmaceutical Biology (Prof. Heilmann) |
| Interdisciplinary Subject Network: | Not selected |
| Keywords: | entomopathogene Pilze, Zytotoxizität, Sekundärmetabolite, Isaria cateniannulata, Beauvericin A, Beauvericin J, Lateritin |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 570 Life sciences 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences 600 Technology > 610 Medical sciences Medicine |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 16039 |
Abstract (German)
Die bisher wenig untersuchten entomopathogenen Pilze als Organismen, die Extremhabitate bewohnen, sind interessant als Quelle neuer bioaktiver Naturstoffe. Besonders weil diese Organismen an ihre Arthropodenwirte gut angepasst sind und die Infektion nicht selten zum Tod der Wirte führt, kann man auf die Beteiligung zytotoxischer oder allgemeiner ausgedrückt biologisch aktiver Pilzmetabolite am ...
Abstract (German)
Die bisher wenig untersuchten entomopathogenen Pilze als Organismen, die Extremhabitate bewohnen, sind interessant als Quelle neuer bioaktiver Naturstoffe. Besonders weil diese Organismen an ihre Arthropodenwirte gut angepasst sind und die Infektion nicht selten zum Tod der Wirte führt, kann man auf die Beteiligung zytotoxischer oder allgemeiner ausgedrückt biologisch aktiver Pilzmetabolite am Infektionsverlauf schließen. In der Krebsforschung besteht eine große Nachfrage nach neuen zytotoxischen Substanzen für die Arzneistoffentwicklung und zur Aufklärung neuer Wirkmechanismen. Besonders Sekundärmetabolite aus Mikroorganismen wie Pilzen sind im Fokus der Forschung als Leitstrukturen und Wirkstoffe.
Mit dem gezielten Screnning von Extrakten aus ausgewählten entomopathogenen Pilzen wurde systematisch nach zytotoxischen Sekundärmetaboliten gesucht. Die Tests resultierten in einer Vielzahl von Extrakten mit zytotoxischer Aktivität, deren intensivere Bearbeitung lohnt. Somit bestätigen die Befunde die Annahme, dass entomopathogene Pilze als Quelle zytotoxischer Substanzen angesehen werden können. Ebenso gelang es, diese Extrakte mit einem entsprechenden Inhaltsstoffspektrum und einer vergleichbaren Aktivität zu reproduzieren. Im Dünnschichtchromatogramm konnten Alkaloide bei mehreren der zytotoxisch wirkenden Extrakte detektiert werden, die für diese Aktivität verantwortlich sein könnten.
Unter den bisher wenig untersuchten Pilzspezies lieferte I. cateniannulata RCEF 0525 einen in den MTT- und WST-1-Assays mit HeLa- bzw. Jurkat-Zellen zytotoxisch wirkenden Myzelextrakt aus der Emerskultur. Aus diesem Extrakt konnten mit Hilfe chromatographischer Verfahren vier zytotoxische Verbindungen isoliert werden, von denen zwei bisher unbekannte Naturstoffe darstellen. Die Strukturaufklärung dieser Verbindungen erfolgte mittels spektroskopischer und spektrometrischer Verfahren, vor allem jedoch mit zweidimensionalen hetero- sowie homonuklearen NMR-Methoden und MS. Zur Charakterisierung der isolierten Substanzen kamen die UV/Vis-Spektroskopie, die Polarimetrie, chromatographische Analysen und die Schmelzpunktbestimmung zum Einsatz. Die Sekundärmetabolite konnten als Cyclodepsipeptide identifiziert werden, die alternierend aus je einer oder drei N-Methylphenylalanin- und verzweigten 2-Hydroxycarbonsäureeinheiten aufgebaut sind. Zwei dieser Verbindungen, Beauvericin A (4) und Lateritin (3), wurden bereits aus anderen entomopathogenen Pilzen, beispielsweise B. bassiana bzw. I. japonica jedoch nicht aus I. cateniannulata, isoliert. In Anlehnung an die Substanzgruppe der Beauvericine wurde das erstmals isolierte Hydroxyderivat mit Beauvericin J (1) bezeichnet. Eine weitere Substanz ist ein Diastereomer von Lateritin (2a/2b), dessen absolute Stereochemie nicht eindeutig geklärt werden konnte.
Da der Extrakt in den Zytotoxizitäts-Assays Wirkung an den eingesetzten Zelllinien HeLa und Jurkat zeigte, wurden die isolierten Reinsubstanzen auf ihre zytotoxische Aktivität untersucht. Für die bisher bekannten Beauvericine und Lateritin ist eine vorwiegend apoptotische Wirkung auf humane Tumorzelllinien bekannt. Alle isolierten Verbindungen zeigen eine zytotoxische Aktivität in unteren µM-Bereich. Die potenteste Verbindung ist Beauvericin A (4), gefolgt von Lateritin (3) und Beauvericin J (1). Das Diastereomer von Lateritin (2a/2b) hat eine deutlich schwächere Aktivität als Lateritin. Die Stereochemie steht demnach in Zusammenhang mit der zytotoxischen Wirkung dieser Substanzen, die somit wahrscheinlich über chirale Moleküle wie Rezeptoren oder Enzyme vermittelt wird.
Die Hauptkomponente Lateritin wurde im Proliferations-Assay auf eine zytostatische Aktivität geprüft, jedoch wurde die eindeutig zytotoxische Wirkung bei Konzentationen über dem IC50-Wert mit diesem Assay bestimmt. Im ECIS-Zytotoxizitäts-Assay wurde die apoptoseinduzierende Wirkung von Lateritin, die schon von Oh et al. beschrieben wurde, bestätigt.[62] Bei der höchsten eingesetzten Konzentration von 50 µM kommt es außerdem partiell zu nekrotischen Prozessen. Der Wirkmechanismus von Lateritin ist bisher wenig untersucht.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine Vielzahl der Extrakte aus entomopathogenen Pilzen als zytotoxisch identifiziert und damit diese als Quelle neuer zytotoxischer Sekundärmetabolite erschlossen. Mit der Charakterisierung und Strukturaufklärung der gefundenen Substanzen gelang es erstmals, zwei unbekannte Verbindungen zusätzlich zu zwei bekannten Verbindungen aus der wenig naturstoffchemisch untersuchten Spezies I. cateniannulata zu isolieren. Jede dieser Substanzen zeigt eine zytotoxische Wirkung, weshalb diese als Leitstrukturen in der Krebsforschung von pharmazeutischem Interesse sein könnten. Ein weiterer Aspekt zukünftiger Grundlagenforschung könnte die Aufklärung des Wirkmechanismus von Lateritin sein.
Translation of the abstract (English)
So far, little is known about entomopathogenic fungi as source of new cytotoxic agents. These organisms inhabit extreme habitats and are well adapted to their arthropod hosts. Because of the lethality of most fungal infections, it is discussed that cytotoxic or conceived in a more general term bioactive constituents synthesized by the fungi are involved in the progression of the infection. ...
Translation of the abstract (English)
So far, little is known about entomopathogenic fungi as source of new cytotoxic agents. These organisms inhabit extreme habitats and are well adapted to their arthropod hosts. Because of the lethality of most fungal infections, it is discussed that cytotoxic or conceived in a more general term bioactive constituents synthesized by the fungi are involved in the progression of the infection. However, there is a great interest in new cytotoxic compounds in cancer research for drug development and investigations of new mechanisms of action. Natural products of microorganisms like fungi play an important role in further investigations as lead and active compounds.
In this systematic screening study, new cytotoxic metabolites were found in extracts of selected entomopathogenic fungi. A substantial number of bioactive extracts have already been identified by cytotoxicity assays. The bioactivity of these extracts has been reproduced to receive comparable constituents and similar activities. Alkaloids, which are discussed to be the active principles, were detected in many of these extracts by thin layer chromatography.
Cultivation of the strain I. cateniannulata RCEF 0525 resulted in a mycelial extract, which shows effects in the cytotoxicity assays. Four cytotoxic compounds were isolated from this extract by chromatographic methods and characterised using UV/Vis spectroscopy, polarimetry, chromatographic analysis and melting point. The structures of these compounds were elucidated by means of spectroscopic and spectrometric methods, especially two dimensional homo- and heteronuclear NMR and MS. The compounds are cyclodepsipeptides composed of alternating N-methylphenylalanines (one or three) and branched 2-hydroxycarbonic acids (one or three). Two of these substances, beauvericin A (4) and lateritin (3), are already known from other entomopathogenic fungi, for example B. bassiana and I. japonica respectively, but not from I. cateniannulata. Two compounds were isolated and identified in this study for the first time. The first is a hydroxyl derivative of beauvericin and was named beauvericin J (1). The second is a diastereomer of lateritin (2a/2b), whose absolute configuration remains still unclear.
The toxicity of the extract in assays with HeLa and Jurkat cells concluded us to test the isolated substances for their cytotoxic properties. The induction of apoptosis in human tumour cell lines of beauvericins and lateritin (3) is already known. Accordingly, all isolated compounds showed cytotoxic activity in lower µM range with beauvericin A (4) being the most cytotoxic compound, followed by lateritin (3) and beauvericin J (1). However, the diastereomer of lateritin (2a/2b) revealed significant lower activity in comparison to lateritin, showing that the stereochemistry influences the toxic effect. This results leads to the conclusion that the cytotoxic pathway is connected with chiral molecules like receptors or enzymes.
In ongoing investigations on the antiproliferative action of the major compound, lateritin (3) showed no cytostatic but cytotoxic properties in concentrations above the IC50 value. The results of the ECIS assays confirm the apoptosis-inducing action of lateritin, previously detected by Oh et al.[62] In concentrations of 50 µM, partial necrotic effects could be observed. Up to now, the mechanism of action of lateritin is not fully understood.
In this study, a substantial number of cytotoxic extracts produced of entomopathogenic fungi were identified. The results show that these fungi can be a source of new natural compounds with cytotoxic effects. The characterisation and structure elucidation of compounds isolated from the mycelial extract of the less investigated I. cateniannulata resulted in two known and two unknown substances. Each compound isolated showed pronounced cytotoxic properties that make them maybe interesting as lead in cancer research. As further prospective, investigations on the cytotoxic signal pathway of lateritin are an interesting aspect to study.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 08:33
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