| Lizenz: Veröffentlichungsvertrag für Publikationen ohne Print on Demand (1MB) |
- URN zum Zitieren dieses Dokuments:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-175830
- DOI zum Zitieren dieses Dokuments:
- 10.5283/epub.17583
| Dokumentenart: | Hochschulschrift der Universität Regensburg (Dissertation) |
|---|---|
| Open Access Art: | Primärpublikation |
| Datum: | 16 November 2010 |
| Begutachter (Erstgutachter): | Prof.Dr. Armin Kurtz und Prof.Dr. Ralph Witzgall |
| Tag der Prüfung: | 23 September 2010 |
| Institutionen: | Biologie und Vorklinische Medizin > Institut für Physiologie > Prof. Dr. Armin Kurtz |
| Themenverbund: | Nicht ausgewählt |
| Stichwörter / Keywords: | Renin1, Renin2, As4.1 Zellen, Olomoucine, EGFP |
| Dewey-Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik > 570 Biowissenschaften, Biologie 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften > 610 Medizin |
| Status: | Veröffentlicht |
| Begutachtet: | Ja, diese Version wurde begutachtet |
| An der Universität Regensburg entstanden: | Ja |
| Dokumenten-ID: | 17583 |
Zusammenfassung (Deutsch)
Das Renin- Angiotensin- System (RAS) ist eine Kaskade proteolytischer Aktivierungen deren biologischer Effektor, Angiotensin II, Blutdruck und Extrazellulärvolumen reguliert. Renin katalysiert dabei den rate limited step und gilt somit als Schlüsselenzym der Kaskade. Renin wird als inaktive Vorstufe Prorenin in den Juxtaglomerulären Zellen gebildet. Die Sekretionsrate aktivierten Renins wird an ...
Zusammenfassung (Deutsch)
Das Renin- Angiotensin- System (RAS) ist eine Kaskade proteolytischer Aktivierungen deren biologischer Effektor, Angiotensin II, Blutdruck und Extrazellulärvolumen reguliert. Renin katalysiert dabei den rate limited step und gilt somit als Schlüsselenzym der Kaskade. Renin wird als inaktive Vorstufe Prorenin in den Juxtaglomerulären Zellen gebildet. Die Sekretionsrate aktivierten Renins wird an den jeweiligen physiologischen Bedarf angepasst. Die intrazelluläre Reninprozessierung ist damit maßgeblich an der Aufrechterhaltung und Funktionsfähigkeit des RAS beteiligt. Den ersten entscheidenden Schritt stellt hierbei die Glykosylierung dar.
Obwohl bereits viele Teilaspekte der zellulären Reninprozessierung durch in- vitro und in- vivo Untersuchungen beantwortet wurden, blieb die Frage nach der Rolle der Glykosylierung für die endogene Aktivierung des Renin bislang offen. Dies ist sicherlich auch darauf zurückzuführen, dass bis heute kein Modell sowohl für optische als auch für biochemische Untersuchungen der Reninprozessierung zur Verfügung steht. Ziel der vorliegenden Arbeit war es durch gezieltes Verpaaren von ausschließlich REN1 (glykosyliert) und REN2 (unglykosylierte) exprimierenden Mäusen ein in- vivo Modell zu etablieren, mit dessen Hilfe die intrazelluläre Prozessierung und Freisetzung von Renin in Abhängigkeit von dem jeweiligen Glykosylierungszustand des Renins charakterisiert werden kann. Dadurch konnte gezeigt werden, dass unter normotensiven Bedingungen die aktive Plasmareninkonzentration der homozygoten REN2- Tiere signifikant gegenüber den REN1- Tieren erniedrigt ist, aber gleichzeitig in diesen Tieren eine erhöhte Renin mRNA Expression vorliegt. In chronischen Stimulationsmanövern konnte sowohl in REN1-, REN1/ REN2- und REN2- Mäusen eine Erhöhung der Renin mRNA Expression und eine Steigerung Plasmareninaktivität - wenn auch auf unterschiedlichen Niveau – erreicht werden kann. Die Erhöhung der Sekretion von aktiven Renin in REN2- Mäusen fällt nach Kurzzeit- Stimulation bereits gegenüber den REN1- und REN1/ REN2- Mäusen deutlich geringer aus. Anhand der isoliert perfundierten Niere konnte gezeigt werden, dass selbst nach Stimulation kein aktives Renin aus den Nieren von REN2 Mäusen freigesetzt wird, sehr wohl aber aus Nieren von REN1 und REN1/REN2 Tieren. Es konnten demnach erstmals, im Zuge dieser Promotionsarbeit, gezeigt werden, dass das aus der Niere sezernierte unglykosyliertes Renin2 bei chronischen Bedingungen die Funktion des glykosylierten Renins übernehmen kann, jedoch nicht bei schnellen, kurzzeitigen Stimulationen des RAAS. Gleichzeitig wurde damit die Notwendigkeit der Glykosylierung des Renins für die Freisetzung aktiven Renins aus der juxtaglomerulären Zelle gezeigt.
In einem weiteren Teil der Arbeit war es möglich ein in- vitro Modell zu etablieren, mit dessen Hilfe die Reninprozessierung auf zellulärer Ebene zukünftig optisch und biochemisch untersucht werden kann. In Rahmen dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die immortalisierte JG- Zelllinie As4.1, die angefertigten Konstrukte nach transienter Transfektion verlässlich exprimiert und die Intensität der Fusionsproteine untereinander sich nicht aufgrund der eingeführten Mutationen unterscheiden. Der notwendige biochemische Nachweis der ReninEGFP- Fusionsproteine konnte durch optimierte Kulturbedingungen der Zellen sowohl im Lysat als auch im Überstand ermöglicht werden. Daher kann zukünftig - nach entsprechendem Bearbeiten der Proben - eine differenzierte Analyse der jeweiligen Stadien der intrazellulären Reninprozessierung erfolgen. Des Weiteren sollte im Rahmen dieser Arbeit die Reninvesikelbildung für optische Untersuchungen optimiert werden. Dies gelang durch den Einsatz des Zellzyklusinhibitors Olomoucine, welcher die Teilungsrate der immortalisierten Zelle verlangsamt. Es konnte damit eine deutlich verbesserte Ausbildung von intrazellulären Reninvesikeln erreicht werden. Die verbesserte Darstellung konnte dabei sowohl in der lebenden Zelle, durch den Einsatz des generierten Konstruktes pRenEGFP, als auch an fixierten Zellen durch spezifische Renin HRP- Färbungen, gezeigt werden. Durch dieses Manöver gelang es außerdem die Sekretionsrate aktiven Renins um einen Faktor 2 zu steigern. Die Voraussetzungen für die mikroskopischen Untersuchungen der Reninprozessierung konnten somit geschaffen werden.
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
The renin- angiotensin system (RAS) is a cascade of proteolytic activations whose biological effector, angiotensin II, regulates blood pressure and extracellular volume. Renin catalyzes in this process the rate limited step and is therefore the key enzyme within this cascade. Renin is generated as inactive precursor from prorenin in the juxtaglomerular cells. The secretion rate of activated renin ...
Übersetzung der Zusammenfassung (Englisch)
The renin- angiotensin system (RAS) is a cascade of proteolytic activations whose biological effector, angiotensin II, regulates blood pressure and extracellular volume. Renin catalyzes in this process the rate limited step and is therefore the key enzyme within this cascade. Renin is generated as inactive precursor from prorenin in the juxtaglomerular cells. The secretion rate of activated renin is adapted to the respective physiological requirement. For this reason intracellular procession of renin is significantly involved in the maintenance and efficiency of the RAS. The first important step at this is the glycosylation.
Although many aspects of the cellular processing of renin have been investigated in in-vitro and in-vivo experiments, the role of the glycosylation of the endogen activation of renin is still remaining. This is certainly contributed to the fact that to date no model for optical as well as biochemical investigation of the processing of renin is available. The aim of the present work was to generate an in-vivo model by directed mating of solely REN1 (glycosylated) and REN2 (un-gylcosylated) expressing mice, which enables to investigate the intracellular processing and secretion of renin in dependence of the related glycosylation of renin. Thereby it was shown that under normotensive conditions the active renin content of the homozyot REN2- mice was significant reduced in comparison to the REN1- mice but also that the latter show an increased renin mRNA expression. By chronic stimulation it was found that REN1-, REN1/ REN2- as well as REN2- mice have an increased renin mRNA expression and an enhanced plasma renin activity - albeit on a different level. After short-term stimulation the increased secretion of active renin was already lower in REN2- mice compared to REN1- and REN1/ REN2- mice. With the method of the isolated perfused kidney it was shown that after stimulation no active renin was released from REN2 mice in contrast to REN1 and REN1/REN2 mice. Therefore it was shown for the first time within this dissertation that from the kidney released unglycosylated renin2 under chronic conditions is able to take over the function of the glycosylated renin. However this will not happen in quick and short-term stimulations. Simultaneously the need of the glycosylation of renin for the release of active renin from the juxtaglomerular cells was revealed.
In a further part of this work it was possible to validate an in-vitro model for the optical and biochemical investigation of the processing of renin at the cellular level. Within this work it was shown that the immortalized JG- cell line As4.1 reliably expresses the prepared constructs after transient transfection and that the intensity of the fusion-proteins is not altered due to the introduced mutations. It was able to perform the necessary biochemical verification of the reninEGFP fusion proteins after optimization of the cell culture conditions in the lysat as well as in the supernatant. Therefore in the future it is possible – after appropriate handling of the samples - to perform a differentiated analyze of the particular phase of the intracellular processing of renin. Furthermore with in the context of this work the formation of renin vesicles should be optimized for optical investigations. This was done by the use of the cell cycles inhibitor olomoucine, which reduced the division rate of the immortalized cells. By doing so a clear improved development of intracellular renin vesicles was achieved. It was able to show the enhanced demonstration in the living cells by the use of the generated pRenEGFP constructs and in fixed cells by a specific renin HRP staining. It was managed by this maneuver to enhance the secretion rate of active renin by a factor of two. Consequently the requirements for microscopic investigation of the processing of renin were created.
Metadaten zuletzt geändert: 26 Nov 2020 08:02
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