| License: Publishing license for publications including print on demand (2MB) |
- URN to cite this document:
- urn:nbn:de:bvb:355-epub-176099
- DOI to cite this document:
- 10.5283/epub.17609
| Item type: | Thesis of the University of Regensburg (PhD) |
|---|---|
| Date: | 26 November 2010 |
| Referee: | Prof. Otto Wolfbeis |
| Date of exam: | 9 November 2010 |
| Institutions: | Medicine > Lehrstuhl für Klinische Chemie und Laboratoriumsmedizin Chemistry and Pharmacy > Institut für Analytische Chemie, Chemo- und Biosensorik |
| Interdisciplinary Subject Network: | Not selected |
| Keywords: | Chromatographie, Flüssigchromatogrpahie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS), Gallensäuren, Glycerophospholipide, Hochdurchsatzanalyse, Hydrophile Interaktionchromatographie (HILIC), Lipidanalytik, Lipoproteine, Massenspektrometrie, Sphingolipide |
| Dewey Decimal Classification: | 500 Science > 540 Chemistry & allied sciences |
| Status: | Published |
| Refereed: | Yes, this version has been refereed |
| Created at the University of Regensburg: | Yes |
| Item ID: | 17609 |
Abstract (English)
The crucial role of lipids in cells, tissues and body fluids is demonstrated by a large number of studies and human diseases that involve the disruption of lipid metabolic enzymes and pathways. Examples for such diseases include cancer, type 2 diabetes and atherosclerosis. Recent advances in research in the field of lipidomics has been driven by the development of new mass spectrometric (MS) ...
Abstract (English)
The crucial role of lipids in cells, tissues and body fluids is demonstrated by a large number of studies and human diseases that involve the disruption of lipid metabolic enzymes and pathways. Examples for such diseases include cancer, type 2 diabetes and atherosclerosis. Recent advances in research in the field of lipidomics has been driven by the development of new mass spectrometric (MS) tools and protocols for the identification and quantification of molecular lipid species in various biological matrices. However, the existing methods for minor sphingolipid (SL), glycerophospholipid (GP) and bile acid (BA) analysis show disadvantages like laborious sample preparation, time consuming LC-separation, high sample volumes or insufficient validation data, excluding these methods for high throughput analysis in huge clinical trials.
The present work presents fast, specific, sensitive and robust LC-MS/MS methods for the analysis of SL, GL and BA species. Chromatographic-separation should provide co-elution of analytes and internal standards within each lipid class. The latter is of major importance to compensate for matrix effects and varying ionization efficiencies. Additionally, these methods should provide automated data analysis tools to allow high sample throughput, a prerequisite for lipid species quantification in huge clinical trials. Finally, these methods should be applied for lipid species analysis in various biological matrices, including plasma, cell homogenates and tissue samples.
1. A method was developed for the simultaneous quantification of phosphatidic acid (PA), phosphatidylglycerol (PG), bis(monoacyl)glycerophosphate (BMP) and cardiolipin (CL) species using hydrophilic interaction chromatography (HILIC) coupled with ESI-MS/MS in positive ionization mode. GL extraction was performed in the presence of butanol. HILIC showed excellent peak shapes and the isobaric compounds PG and BMP were successfully baseline-separated. Furthermore, HILIC provides co-elution of lipid species and their internal standards. Since many lipid species differ only by their chain length and/or saturation degree, co-elution may exhibit isotopic overlap which has to be corrected. Therefore, theoretically calculated isotope profiles were implemented into self programmed Excel Macros, which successfully corrected, for the first time, this complex isotopic overlap of an MS/MS experiment.
2. As one major achievement of this thesis, LC-MS/MS methods for the analysis of various low abundant SLs were developed. Separation of distinct SL classes and co-elution of analytes and internal standards was achieved by HILIC. MS/MS-analysis was either conducted in negative ionization mode for S1P and LPA quantification, or in positive ionization mode for the quantification of SPH and metabolites as well as for HexCer and LacCer. Since these methods use the same butanolic extraction and LC components, it is possible to analyze both sets of analytes from one extract. Treatment of fibroblasts with myriocin, which inhibits the first step of SL biosynthesis, and sphingosine-kinase inhibitor, demonstrated the importance of methods covering multiple instead of single sphingolipid metabolites. Additionally, SLs were quantified in plasma and in lipoprotein fractions prepared by fast performance liquid chromatography (FPLC). SLs showed a specific distribution across lipoprotein classes and the SL species profiles in separated lipoproteins may help to address the origin of plasma SLs.
3. BA species were quantified from human plasma/serum using ESI-MS/MS in negative ionization mode. LC-separation was performed with a reversed phase-C18 column and a gradient elution at basic pH was applied. Baseline-separation of eighteen BA species (free and conjugated) and a high sensitivity was achieved within 6.5 min runtime. The sample preparation procedure was based on protein precipitation with acetonitrile. Validation was performed according to FDA guidelines. This method provides a valuable tool for both, routine diagnostics and the evaluation of BAs as diagnostic biomarkers in large clinical studies.
Translation of the abstract (German)
Die äußerst wichtige Rolle von Lipiden in verschiedenen Zellen, Geweben und Körperflüssigkeiten wurde durch eine Reihe von Studien gezeigt. Viele Krankheiten stehen in engem Zusammenhang mit Störungen im Lipid-Stoffwechsel. Beispiele für solche Krankheiten sind unter anderem Krebs, Typ 2 Diabetes und Arteriosklerose. Neueste Ergebnisse im Bereich der „Lipidomics“, wurde durch die Entwicklung ...
Translation of the abstract (German)
Die äußerst wichtige Rolle von Lipiden in verschiedenen Zellen, Geweben und Körperflüssigkeiten wurde durch eine Reihe von Studien gezeigt. Viele Krankheiten stehen in engem Zusammenhang mit Störungen im Lipid-Stoffwechsel. Beispiele für solche Krankheiten sind unter anderem Krebs, Typ 2 Diabetes und Arteriosklerose. Neueste Ergebnisse im Bereich der „Lipidomics“, wurde durch die Entwicklung neuartiger massenpektrometrischer Tools für die Identifizierung und Quantifizierung molekularere Lipid-Spezies in verschiedenen biologischen Materialien, vorangetrieben. Bereits existierende Methoden für die Analyse von gering konzentrierten Sphingolipiden (SL), Glycerophospholipide (GP) und Gallensäuren weisen deutliche Limitationen hinsichtlich aufwendiger Probenvorbereitungen, langen chromatographischen Trennungen, hohen Probenvolumina oder unzureichenden Validierungs-Daten auf. Aus diesem Grund sind diese Methoden nicht geeignet für Biomarker-Screening in großen klinischen Studien.
Die vorliegende Arbeit beschreibt schnelle, sensitive und robuste analytische Methoden für die Quantifizierung von SL, GL und Gallensäuren mittels Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS). Die chromatographische Trennung sollte hinsichtlich der Co-Elution von Analyten und internen Standards optimiert werden. Diese ist Voraussetzung um potentielle Matrix-Effekte und unterschiedliche Ionisationseffizienzen auszugleichen. Für den Einsatz in großen klinischen Studien, sollte die Datenauswertung automatisiert werden, um einen hohen Probendurchsatz zu gewährleisten. Neben Blutplasma sollten auch andere biologische Materialien, wie kultivierte Zellen und Gewebe eingesetzt werden.
1. Zunächst wurde eine Methode für die simultane Analyse von Phosphatidsäure (PA), Phosphatidylglycerol (PG), Bis(monoacyl)glycerolphsophat (BMP) und Cardiolipin (CL) entwickelt. Quantifizierung dieser Lipide erfolgte durch hydrophile Interaktionschromatographie (HILIC) gekoppelt mit ESI-MS/MS im positiven Ionisations-Modus. HILIC zeichnete sich durch optimale Peak-Qualitäten und Basislinien-Trennung der isobaren Komponenten PG und BMP aus. Zusätzlich wurde durch den Einsatz von HILIC eine Co-Elution der Lipid-Spezies und der zugehörigen internen Standards erreicht. Da sich viele Lipid-Spezies nur in ihrer Kettenlänge und/oder ihrem Sättigungsgrad unterscheiden, führt Co-Elution zu einem Isotopen-Überlapp, der korrigiert werden muss. Aus diesem Grund wurden theoretisch berechnete Isotopen-Profile in selbst-programmierte Excel-Makros implementiert. Der komplexe Isotopen-Überlapp wurde im Folgenden, zum ersten Mal, in einem MS/MS-Experiment erfolgreich korrigiert.
2. Als weiterer Schwerpunkt dieser Doktorarbeit sollten neue analytische Methoden für den Nachweis und für die Quantifizierung von verschiedenen Sphingolipiden entwickelt werden. Durch die Anwendung von HILIC wurden die verschiedenen SL-Klassen erfolgreich getrennt, und gleichzeitige Co-Elution von Analyten und Internen Standards konnte erreicht werden. Charakterisierung mittels MS wurde für S1P und LPA im negativen Ionisationsmodus, für SPH und Metabolite sowie für HexCer und LacCer, im positiven Ionisationsmodus durchgeführt. Da beide Methoden die identische butanolische Extraktion, und die gleichen chromatographischen Komponenten verwenden, konnte das komplette SL Profil aus demselben Extrakt bestimmt werden. Ein Inkubations-Experiment von Fibroblasten mit Myriocin, einem Inhibitor des ersten Schrittes der SL-Biosynthese, und einem Sphingosinkinase-Inhibitor zeigte Veränderungen des SL-Profils. Um weitere wichtige Erkenntnisse des SL-Stoffwechsels in Zusammenhang mit verschiedenen Erkrankungen zu gewinnen ist es daher wichtig, kombinierte Methoden, die eine Vielzahl von Metaboliten erfassen, anzuwenden. In einem zusätzlichen Experiment wurden SL in Plasma und in FPLC-getrennten Lipoprotein-Fraktionen quantifiziert. SLs zeigten eine spezifische Verteilung über die verschiedenen Lipoprotein-Klassen.
3. Gallensäuren wurden aus humanem Plasma/Serum mittels ESI-MS/MS in negativem Ionisations-Modus quantifiziert. Die chromatographische Trennung erfolgte mit einer Umkehrphase C18-Säule. Innerhalb von 6.5 min wurden 18 verschieden Gallensäuren mittels Gradienten-Elution unter basischen Bedingungen getrennt. Als Probenvorbereitung wurde eine Proteinfällung mit Hilfe von Acetonitril angewendet. Da diese Methode im Rahmen der Routinediagnostik und in großen klinischen Studien eingesetzt wird, wurde eine Validierung auf Grundlage der FDA-Richtlinien durchgeführt.
Metadata last modified: 26 Nov 2020 08:02
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